农杆菌介导的大豆的转化

1、 大大豆的转豆的转化化周宇周宇v利用转基因技术将目的基因导入植物受体细胞,使目的基因在植物受体中表达,从而获得优良性状的植株,达到快速培育植物新品种的目的。大豆转基因的方法大豆转基因的方法v农杆菌转化法v基因枪法v花粉管通道法vPEG法v电击法、超声波法农杆菌转化法农杆菌转化法v 基本原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。6 6大功能区：大功能区：1)1)致癌区，这个区主要合致癌区，这个区主要合成成 植物生长素和细胞分裂素；植物生长素和细胞分裂素；2)2)冠瘿碱合成区；冠瘿碱合成区

2、；3)3)冠瘿碱分解区；冠瘿碱分解区；4)Ti4)Ti质粒接合转移区质粒接合转移区(tra)(tra)；5)5)毒性区（毒性区（VirVir）；）；6)DNA6)DNA复制区（复制区（RepRep）。）。在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧存在着一个25 bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA，插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。T-DNAT-DNA农杆农杆菌的侵染过程菌的侵染过程v1. 农杆菌积聚 v2. vir基因的诱导表达v3. T-DNA复合物的形成v4. T-DNA转人并整合到植物基因组1. 农杆菌积聚农杆菌积聚外植体损伤可以诱导乙酰丁外植体损伤可以诱导乙酰丁

3、香香酮（酮（AcetosyringoneAcetosyringone，ASAS）和）和羟基乙酰丁香酮等羟基乙酰丁香酮等酚类物质的酚类物质的产产生。生。2.vir2.vir基因的诱导表达基因的诱导表达v外植体损伤产生的这些酚类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物,又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区(毒性区)基因的诱导物,从而使Vir区基因活化。3. T-DNA复合物的形成4. T-DNA转人并整合到植物基因组v当农杆菌接受到此类信号时，其vir区基因可被诱导转录。v目前发现10多种 Vir区基因表达产物参与T-DNA转移过程，包括VirA， VirB， VirC， VirD，VirE，VirF，V

4、irG，VirH等蛋白家族群。vvir基因表达的产物作用于T-DNA产生T-DNA链，进而转化形成T-DNA复合体，随后在植物及细菌蛋白的共同作用下被摄入细胞核内。v二元载体系统（binary vector system)，v一个克隆载体和一个辅助质粒共同组成。v借助农杆菌的感染实现借助农杆菌的感染实现外源基因外源基因向植物向植物细胞的转移与整合后，怎样再生出转基细胞的转移与整合后，怎样再生出转基因植株呢？因植株呢？v答案是：通过细胞和组织培养技术。答案是：通过细胞和组织培养技术。大豆的再生体系大豆的再生体系v大豆器官发生再生系大豆器官发生再生系统统 子叶节，无菌苗茎尖，成熟胚子叶，幼胚轴以及

5、下胚轴均可作为诱导再生植株的外植体v大大豆体细胞胚胎发生再生系统豆体细胞胚胎发生再生系统 大豆遗传转化受体材料中的细胞胚主要以未成熟胚的子叶为外植体，经诱导后形成体细 胞胚，然后获得再生植株v原原生质体再生系统生质体再生系统 首先获得愈伤组织并诱导成苗，得到再生植株具体操作步具体操作步骤骤（1）大豆种子的消毒 选取种皮光滑无病斑、无裂痕、无霉变的成熟大豆种子，采用氯气熏蒸法进行消毒。v1. 将种子放入培养皿，将培养皿放入通风橱的干燥器中； v2. 在干燥器的烧杯中加入100mL 次氯酸钠溶液； v3. 沿烧杯壁加入4mL浓度 为12N的盐酸溶液； v4. 关闭干燥器，过夜放置 16-18小时；

6、 Seed sterilization （2）大豆种子的萌发v消毒后的种子被直接播种于萌发培养基中，培养皿不封口。将萌发培养基放入环境条件为温度25，光照周期18hr/d，培养室中萌发4-6天。v萌发培养基 成分： B5加入2%的蔗糖 ， 0.8%琼脂，pH调到5.8。 Seed germination （3）农杆菌的准备v在YEP平板中挑取农杆菌单克隆3-4个，接种于2ml含相应抗生素的YEP液体培养基中，温度28，转速250 rpm过夜培养，使菌液达饱和。v将上述培养菌液加入200mL 含相应抗生素的 YEP 液体培养基，温度 28，转速 250rpm 培养至对数生长期（OD650=0.6

7、-1.0）。v分别向每50 mL离心管中分装40mL上述菌液，常温，转速3500rpm 离心10分钟。v将离心管中的 YEP培养基倒掉，加入重悬液，吹吸使菌体充分悬浮，使用重悬液将菌液重悬，温度28，转速160rpm摇至OD650=0.6，形成工程菌液。vYEP固体培养基 5 g/L酵母膏, 10 g/L 蛋白胨, 5 g/L NaCl2, 12 g/L琼脂.pH调到7.0 ， 灭菌后加入抗生素，倒入100 x15 平板中(每个平板大约25mL). vYEP液体培养基 5 g/L酵母膏, 10 g/L 蛋白胨, 5 g/L NaCl2， pH调到7.0，灭菌后加入抗生素。 （4）外植体的准备与

8、侵染v切取萌发良好的大豆子叶外植体，除去种皮，保留长度约0.5厘米的下胚轴。沿下胚轴将两片子叶竖直切开，剥离胚芽，将切下的外植体置于菌液中，沿子叶节处向下平行用手术刀划伤8-10次。v准备60个半种子的外植体，放入100 x 25 mm平板中，并加入30mL的侵染培养基，室温下侵染30分钟。v侵染培养基 1/10 X Gamborg B5 Basal Medium (Contains: 1/10X B5 major salts, 1/10X B5 minor salts, 1/10X B5 vitamins, 2.8 mg/L Ferrous, 3.8 mg/L NaEDTA), 30 g/L

9、 Sucrose, 3.9 g/L MES, pH 5.4. Filter sterilized GA3 (0.25 mg/L), BAP (1.67 mg/L), and 40 mg/L acetosyringone are added to this medium after autoclaving. （5）共培养v浸染结束后，使用无菌滤纸清除外植体表面多余菌液，将外植体子叶内面向下平放在表面附有灭菌滤纸的共培养培养基中进行培养，用 Parafilm 封口，置于培养室中，温度 24，光照时间18小时，共培养 5天。 共培养培养基共培养培养基v1/10X Gamborg B5 Basal M

10、edium (Contains: 1/10X B5 major salts, 1/10X B5 minor salts, 1/10 B5 vitamins, 2.8 mg/L Ferrous, 3.8 mg/L NaEDTA), 30 g/L Sucrose, 3.9 g/L MES, and 4.25 g/L Noble agar, pH 5.4. Filter sterilized GA3 (0.25 mg/L), BAP (1.67 mg/L), Cysteine (400 mg/L), Dithiothrietol (154.2 mg/L), and 40 mg/L acetosyri

11、ngone are added to this medium after autoclaving. Co-culture （6）生芽诱导生芽诱导v使用丛生芽诱导液体培养基（含抑菌抗生素）清洗共培养后的外植体，浸泡 30分钟后，用滤纸吸取表面多余液体培养基，将子叶内面向上倾斜 30-45度角插入芽诱导培养基（Shoot Induction Medium I, SIM-I）中，每皿8-10个外植体。将培养皿置于温度25，光照18h的培养室中，培养两周。 将外植体取出，用刀片除去顶芽，保留丛生芽，在下胚轴包埋面下方进行切面处理，露出新鲜的组织。将外植体插入芽诱导培养基（Shoot Induction

12、 Medium II, SIM-II）中，每皿8-10个外植体。将培养皿置于温度25，光照时数18h培养室，培养两周。v芽诱导培养基芽诱导培养基 v1X Gamborg B5 Basal Medium (Contains: 1X B5 major salts, 1X B5 minor salts, 1X B5 Vitamins, 28 mg/L Ferrous, 38 mg/L NaEDTA), 30 g/L Sucrose, 0.59 g/L MES, and 7 g/L Noble agar, pH 5.7. Filter sterilized BAP (1.11 mg/L), Timen

13、tin (50 mg/L), Cefotaxime (100 mg/L), Vancomycin (50 mg/L) and Glufosinate (8 mg/L) are added to this medium after autoclaving. Pour into sterile 100 x20 mm plates (26 plates/L).Shoot induction（7）芽伸长芽伸长v选取分化良好的外植体，除去死芽和大芽，切掉子叶部分，在外植体底面进行切面处理，露出新鲜的组织。将外植体转入芽伸长培养基中，温度 25，光照时数 18小时，培养两周。 v芽伸长培养基芽伸长培养基v

14、1X MS Modified Basal Medium with Gamborg Vitamins (Contains: 1X MS major salts, 1X MS minor salts, 1X B5 vitamins, 28 mg/L Ferrous, 38 mg/L NaEDTA, 30 g/L Sucrose, 0.59 g/L MES, and 7 g/L Noble agar, pH 5.7.Filter sterilized Asparagine (50 mg/L), L-Pyroglutamic Acid (100 mg/L), IAA (0.1 mg/L), GA3 (

15、0.5 mg/L), Zeatin-R (1 mg/L), Timentin (50 mg/L), Cefotaxime (100 mg/L), Vancomycin (50 mg/L), and Glufosinate (8 mg/L) are added to this medium after autoclaving. Pour into sterile 100 x25 mm plates (22 plates/L). Shoot elongation（7）生根生根v芽伸长时期的再生芽长到3厘米以上时可进行生根处理。将伸长芽切下转入生根培养基诱导生根，在温度 25、光照周期 18小时的条件下培养至再生苗生出 3-6 条主根。v生根培养基生根培养基v X MS Modified Basal Medium with Gamborg Vitamins (Contains X MS major salts, X MS minor salts, X B5 vitamins, 28 mg/L Ferrous, 38 mg/L NaEDTA), 20 g/L Sucrose, 0.59 g/L MES, and 7 g/L Noble agar, pH 5.6. Filter sterilized Indole-