基因工程-克隆基因的表达

1、8/5/202118/5/202128/5/20213遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质到蛋白质的传递过程的传递过程中心法则中心法则（central dogma）。）。 一、基因表达：一、基因表达：8/5/20214二、克隆基因的表达：二、克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。8/5/202158/5/20216第一节第一节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中

2、的表达第二节第二节 外源基因在真核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达8/5/20217第一节第一节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达一、一、原核生物基因表达的特点原核生物基因表达的特点二、二、原核生物基因表达的调控原核生物基因表达的调控四、四、几种类型的原核表达载体几种类型的原核表达载体五、五、影响外源基因表达效率的因素影响外源基因表达效率的因素8/5/20218六、提高表达水平常用的方法六、提高表达水平常用的方法七、七、细菌表达载体举例细菌表达载体举例八、八、外源蛋白质表达后的正确修饰外源蛋白质表达后的正确修饰九、九、原核细胞表达的缺陷原核细胞表达的缺陷8/5/202

3、19用原核生物作宿主。用原核生物作宿主。A dividing E. coli第一节第一节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子MCSSD序列序列终止子终止子8/5/202110识别原核细胞的识别原核细胞的启动子启动子，催化所有的，催化所有的RNA合成。合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点2. 以操纵子为单位以操纵子为单位1. 只有一种只有一种RNA多聚酶多聚酶8/5/202111有意义链有意义链5反意义链反意义

4、链3转录转录mRNA53翻译翻译蛋白质蛋白质NC533. 转录和翻译偶联、连续进行。转录和翻译偶联、连续进行。8/5/2021128/5/2021134. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5. 调控主要在转录水平上。调控主要在转录水平上。 含有一个启始密码子和一段同核糖体含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列。6. mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:8/5/202114是是DNA上的能与上的能与RN

5、A聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（顺序（consensus sequence）。二、原核生物基因表达的调控二、原核生物基因表达的调控1. 启动子启动子-35 Box 和和 -10 Box（1） 启动子序列启动子序列 8/5/202115consensus sequences8/5/2021165-TTGACA-35-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACATATAAT 转录起始位点转录起始位点17bp5核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识

6、别位点亚基的识别位点 。 -35box8/5/202117（2）翻译的起始位点）翻译的起始位点1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。SDmRNA 5AGGAGGUAUG16S rRNA3UCCUCCAS-DS-D序列距离序列距离AUGAUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译8/5/202118全酶是一个全酶是一个5 5聚体，含有两个聚体，含有两个小亚基小亚基，和，和2 2两个大亚基（两个大亚基（和和），一个），一个亚基。亚基。2. RNA多聚酶多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录

7、多聚酶转录tRNA，rRNA和和mRNA。（1 1）结构）结构8/5/2021193. 转录终止子转录终止子内终止子内终止子 intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有位置有一段一段反向回文顺序反向回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。段转录终止子。启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子8/5/202120由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性的配对，稳

8、定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。延续。 原因：原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了数降低，整个减弱了RNA与与DNA的互补。的互补。 茎环结构茎环结构 多聚多聚A/UA/U8/5/2021215-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCA

9、CAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNAmRNA折叠折叠U CU CC CU GU GG GC CA AUUC CG GC CG GG GC CC CG GC CG GG GC CA AA ACCCAC UUUUCCCAC UUUU3 3DNARNA聚合酶聚合酶脱落脱落8/5/2021228/5/202123大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上。一般安置上全部的三个全部的三个终止密码终止密码防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）。）。4. 翻译终止密码翻译终止密码5. 翻译增强子翻译增强子 Translation en

10、hancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前导序列（简称g10-L序列）序列）;大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR中富含中富含U的区段。的区段。8/5/202124 必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的总蛋白的10%-30%以上。以上。 应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。便于表达毒性蛋白等。应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂

11、诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件）最佳启动子必须具备的条件6. 基因工程常用的原核启动子基因工程常用的原核启动子 8/5/202125来自大肠杆菌的来自大肠杆菌的乳糖操纵子。乳糖操纵子。用乳糖或其类似用乳糖或其类似物物IPTG充当诱导充当诱导物，与阻遏蛋白物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。结合，解除抑制。Plac O目的基因目的基因（2） 乳糖启动子乳糖启动子lac8/5/2021268/5/2021278/5/202128（3）色氨酸启动子）色氨酸启动子trptrpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1P2启动子；启动子；O操纵基因；

12、操纵基因； 衰减子衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。8/5/202129trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA邻氨基苯甲邻氨基苯甲酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油硼酸合成酶硼酸合成酶色氨酸色氨酸合成酶合成酶 链链 链链分支酸分支酸邻氨基邻氨基苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘油油-磷酸磷酸色氨酸色氨酸阻遏物阻遏物转录转录（P1P1是主要启动子，是主要启动子，P2P2的作用只有的作用只有3%3%。）。）没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的

13、酶。结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。8/5/202130trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA阻遏物阻遏物色氨酸色氨酸结合结合不转录不转录用于表达载体的用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分操纵基因、和部分trpE基因。基因。P1OtrpE目的基因目的基因有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为酶类的转录（称为corepressor）。）。8/5/2021318/5/2021321. 细胞质中表达细胞

14、质中表达2. 周质中表达周质中表达3. 胞外表达胞外表达8/5/2021331. 细胞质中表达细胞质中表达（1）包涵体（）包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白不溶性蛋白质质聚集折叠而成的晶体结构物。聚集折叠而成的晶体结构物。8/5/202134例：例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞。不损害寄主细胞。回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。 缺点缺点 优点优点8/5/2021358/5/2021368/5/2021372. 周质中表达周质中表达（1）周质（）周质（periplasm

15、）革兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间革兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚机理目前不完全清楚优点：优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。被降解的少。8/5/202138phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（内酰胺酶（lactamase）、）、肠毒素（肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等等u 常用的原核信号肽常用的原核信号肽大肠杆菌的信号肽：大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需能带领

16、蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。要正确切割掉。（2）信号肽（）信号肽（signal peptide）一般位于一般位于N N端。端。8/5/202139胡萝卜欧氏杆菌的胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。蛋白。金黄色葡萄球菌的蛋白金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。）。8/5/202140由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。太理想。用溶血素（用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性）基因构建分泌性融合蛋白；融

17、合蛋白；使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分分泌到细胞外泌到细胞外的培养基中。的培养基中。3. 胞外表达胞外表达或与细菌素释放蛋白（或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。共表达。8/5/2021418/5/202142载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。任何蛋白质融合在一起。S-D序列序列 AUG-外源基因外源基因-TAG优点优点:四、几种类型的原核表达载体四、几种类型的原核表达载体1. 非融合型表达载体非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋产物结构接近

18、于真核细胞体内的蛋白质结构。白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。8/5/202143哈佛大学的哈佛大学的Gilbert实验室建立的。实验室建立的。表达能力强。表达能力强。（1）pKK223-3 载体载体组成结构：组成结构： 强启动子强启动子: tac（trp-lac）:trp的的-35区区lacUV5的的-10区区lac操纵基因操纵基因 操纵基因：操纵基因：乳糖操纵子系统。乳糖操纵子系统。8/5/202144终止子：终止子：调节基因：调节基因：Lac I宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如如JM105菌。菌。rrnB的强

19、终止子的强终止子rrnB强终止子强终止子S-D插入位点区插入位点区S-D序列和插入位点区：序列和插入位点区：8/5/202145tac PLac O S-D 插入位点区插入位点区rrnB T宿主宿主lac I载体的其余部分：载体的其余部分：来自来自pBR322质粒。质粒。表达诱导物：表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物阻遏物IPTG8/5/202146必须选择一个有必须选择一个有lacI（-半乳糖苷酶半乳糖苷酶的调节基因的调节基因 ）的宿）的宿主菌。主菌。条件：条件：8/5/202147载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信载体表达出的外源蛋白质与

20、细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。质中。如：如：pIN III系列：系列： 2. 分泌型表达载体分泌型表达载体pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）组成结构）组成结构8/5/202148Ipplac P lac O S-D/AUG ompa 插入位点插入位点Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。启动子。调节基因：调节基因：lac IS-D序列和起始密码序列和起始密码AUG。分泌信号肽：分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位

21、点区（多克隆位点）。插入位点区（多克隆位点）。 强启动子：强启动子：8/5/202149pIN III-comA1以以pBR322为为基础构建的。基础构建的。调节基因不必调节基因不必借助于宿主的借助于宿主的lacI.8/5/202150表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。体上的菌体蛋白连接在一起的。启动子：启动子：tac操纵基因：操纵基因：lacP调节基因：调节基因：lacIS-D序列序列3. 融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统-pGEX系列系列（1）优点）优点（2）组成结构）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。便于融合蛋白的分离

22、和纯化。8/5/202151lacItac lac O S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacPori：pBR322 ori融合肽：融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose（谷胱甘肽琼脂糖凝胶谷胱甘肽琼脂糖凝胶 ）亲和层析柱亲和层析柱分离纯化。分离纯化。（3）产物提纯）产物提纯8/5/202152（4）产物分离）产物分离用凝血酶或用凝血酶或Xa因子（因子（一种丝氨酸蛋白酶一种丝氨酸蛋白酶）可以把外源蛋白从可以把外源蛋白从GST上切下来。上切下来。柱（柱（column） GST 外源蛋白外源蛋白凝

23、血酶凝血酶外源蛋白外源蛋白柱（柱（column） GSTGST洗脱洗脱柱（柱（column）可再利用可再利用8/5/2021535-TTGACA-35-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）五、影响外源基因表达效率的因素五、影响外源基因表达效率的因素1. 启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点（1）一致顺序）一致顺序8/5/202154（2）-35区与区与-10区之间的距离区之间的距离间隔为间隔为17bp时，启动子最强。时，启动子最强。（3） -35区和区和-10区的碱基顺序区的碱基顺序越接近一致

24、顺序，启动子越强。越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACATATAAT一致顺序一致顺序lactrp PLrecAtac Itac II5-TTTACATATGTT5-TTGACATTAACT5-TTGACAGATACT5-TTGATATATAAT5-TTGACATATAAT5-TTGACATTTAAT-35box-10box8/5/2021555-AGGAGGU-3S-D序列后面的序列后面的4个碱基：个碱基：如果是如果是A（T）, 翻译效率最高；翻译效率最高；如果是如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。2. 转译起始序列对表达效率的影响转译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序

25、列序列？8/5/202156AUG左侧的三个碱基也有影响。左侧的三个碱基也有影响。（2）起始密码）起始密码AUG -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA中：中：AUG左侧如果是左侧如果是UAU或或CUU时，最时，最为有效；为有效；如果是如果是UUC、UCA或或AGG时下降时下降20倍。倍。8/5/2021573. 启动子与外源基因之间的距离启动子与外源基因之间的距离8/5/202158转录终止区的存在保证载体转录终止区的存在保证载体不会转录非必须不会转录非必须基因基因，不必浪费资源量和能量、不会干扰正，不必浪费资源量和能量、不会干扰正常的表达。常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的增加载体的拷贝

26、数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。数目。增加表达效率。4. 转录终止区对表达效率的影响转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。8/5/2021591. 选择强启动子序列，如选择强启动子序列，如tac 等等六、提高表达水平常用的方法六、提高表达水平常用的方法2. 调整调整S-D序列与序列与AUG的距离的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。距离过长或过短都影

27、响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。根据不同的启动子选择不同的距离。3. 改变起始密码下面的几组密码子改变起始密码下面的几组密码子能提高翻译的起始效率。能提高翻译的起始效率。8/5/2021604. 增加增加mRNA的拷贝数和稳定性的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入在外源基因的下游插入“重复性基因重复性基因外回文序列外回文序列”能防止能防止mRNA受到受到35外切酶的攻击。外切酶的攻击。5. 减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。达的关系。8/5/202161N末端：由原核基因编码一段多肽，末端

28、：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。（1）设计成融合蛋白）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物质粒基因产物 目的基因产物目的基因产物NC切割切割6. 提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。防止被宿主的酶降解。8/5/202162使用次黄嘌呤核苷（使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。减少宿主菌的蛋白酶合成。大肠杆菌的大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶基因突变也减少蛋白酶的降解作用。的降解作用。T4噬菌体的噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的

29、蛋基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把白酶。可把pin增加到载体上。增加到载体上。（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。8/5/202163（3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白 细胞质细胞质外膜外膜内膜内膜周间质周间质质粒质粒染色体染色体“外排外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。8/5/202164七、细菌表达载体举例七、细菌表达载体举例colE orilacIintein

30、CBDMCST7PromotorAmprM13 orirop维持拷贝数维持拷贝数pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12 几丁质结合几丁质结合1. pTYB1，pTYB2: intein在在C端端pTYB系列系列E.coli表达载体：表达载体：8/5/202165inteinintein指蛋白质的内含子。指蛋白质的内含子。同同mRNAmRNA一样，一些前体蛋白质具有内含子一样，一些前体蛋白质具有内含子(intein)(intein)序列，位于序列，位于多肽序列的中间多肽序列的中间, ,经加工切除后，两端的蛋白质外显子经加工切除后，两端的蛋白质外显子 (extein(extein) )

31、连接为成熟蛋白质分子。连接为成熟蛋白质分子。特点：特点：. . 切割位点保守：切割位点保守：内含子前面常为半胱氨酸，后面序列是组氨酸天门冬酰胺；内含子前面常为半胱氨酸，后面序列是组氨酸天门冬酰胺；内含子后面外显子序列的前面常是半胱氨酸、丝氨酸内含子后面外显子序列的前面常是半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸；存在一些保守序列。和苏氨酸；存在一些保守序列。. . 具有自动切割加工能力：具有自动切割加工能力：如果蝇胚胎发育的内含子蛋白质如果蝇胚胎发育的内含子蛋白质(Hedgehog)(Hedgehog)。. . 蛋白质内含子片段具有核酸内切酶活性：蛋白质内含子片段具有核酸内切酶活性：杂合体中，无内含子的杂合体

32、中，无内含子的DNADNA序列，经内含子的切割跳跃而成为序列，经内含子的切割跳跃而成为纯合子。纯合子。 8/5/2021662. pTYB11，pTYB12: intein在在N端端8/5/202167利用利用Intein 分离纯化外源蛋白分离纯化外源蛋白Intein与与Chitin柱结合柱结合DTT或或-巯基乙醇或半胱氨酸能够巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导诱导Intein的自我裂解活性的自我裂解活性8/5/2021688/5/202169八、外源蛋白质表达后的正确修饰八、外源蛋白质表达后的正确修饰分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折

33、叠。构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1. 形成正确的二硫键形成正确的二硫键 8/5/202170人胰岛素分子人胰岛素分子8/5/202171抗体分子抗体分子人血红蛋白分子人血红蛋白分子8/5/202172如信号肽、内含肽（如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。）等序列的切割。2. 前体切割前体切割 8/5/202173（1 1）O-糖基化（糖基化（Ser, Thr）增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。3. 蛋白质糖基化蛋白质糖基化 糖基糖基8/5/202174（2）N-糖基化（糖基化（Asn）Dol：长醇：长醇Mannose：甘露糖：甘露糖Glucose

34、：葡萄糖：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖8/5/202175磷酸化、乙酰化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆化、羰基化、豆冠酸化、软脂化冠酸化、软脂化4. 氨基酸残基的修饰氨基酸残基的修饰 羟脯氨酸羟脯氨酸甲基组氨酸甲基组氨酸羟赖氨酸羟赖氨酸羧基谷氨酸羧基谷氨酸8/5/202176缺乏蛋白质的加缺乏蛋白质的加工。工。（如糖基化、氨（如糖基化、氨基酸修饰等）。基酸修饰等）。九、原核细胞表达的缺陷九、原核细胞表达的缺陷8/5/202177酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。第二节第二节 外源基因在真核细胞中的表

35、达外源基因在真核细胞中的表达真核或病毒启动子真核或病毒启动子 MCS PolyA信号信号 终止子终止子外源基因外源基因8/5/202178 能在能在E.coli中克隆和扩增。中克隆和扩增。1. 酵母克隆载体酵母克隆载体一、在酵母中表达一、在酵母中表达Leu2+ +、His+ +、Ura3+ +、Trp1+ +; 有合适的克隆位点。有合适的克隆位点。 有酵母的选择标记有酵母的选择标记Ori有有大肠杆菌的选择标记大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。8/5/202179Leu- - 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG整合到染色体上，整合到染色体上，或独立在酵母细胞内

36、或独立在酵母细胞内转化转化Leu营养营养缺陷型缺陷型培养基培养基筛选筛选转化子克隆生长转化子克隆生长酵母载体酵母载体大肠杆菌大肠杆菌提取提取插入外源基因插入外源基因鉴定克隆鉴定克隆发酵表达发酵表达外源基因产物外源基因产物分离、纯化分离、纯化2. 酵母转化和表达的一般过程酵母转化和表达的一般过程 8/5/2021803. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白在啤酒酵母中表达的重组蛋白8/5/2021818/5/202182（1）细胞质内表达）细胞质内表达例：人例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：在酵母中表达：4. 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式超氧化物超氧化物H+ +H2O

37、2H2O过氧化物酶过氧化物酶表达出的表达出的SOD修饰正确：修饰正确：起始氨基酸被切掉，起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶) )8/5/202183宿主：宿主：亮氨酸合亮氨酸合成缺陷型成缺陷型酵母。酵母。GAPD：甘油醛磷甘油醛磷酸脱氢酶酸脱氢酶8/5/202184（2 2）表达分泌型蛋白）表达分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。糖基化。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法：方法：构建载体构建载体在重组蛋白的前

38、面加一段编码酵母菌交在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的的前导肽，与重组蛋白的N端通过端通过Lys-Arg相连。相连。前导肽（前导肽（leader peptide）：）：8/5/202185蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶内切蛋白酶识别这个切点信号，把重识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。组蛋白正确切下来。信号肽的切割：信号肽的切割：前导肽前导肽 Lys-Arg 重组蛋白（水蛭素）重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶内切蛋白酶8/5/2021865.5.其它酵母表达系统其它酵母表达系统（1 1）乙肝表面抗原在嗜甲

39、烷酵母中表达乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；在大型发酵反应器中容易生长；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的有甲醇时，表达的乙醇氧化酶乙醇氧化酶高达胞高达胞内总蛋白的内总蛋白的40%！嗜甲烷酵母（嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点）的特点8/5/202187HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3-ao

40、x1：整合到特定染色体的位点序列。：整合到特定染色体的位点序列。表达载体构建（整合型）：表达载体构建（整合型）：诱导物：甲醇。诱导物：甲醇。产量：产量：9106剂疫苗剂疫苗/240L发发酵液。酵液。8/5/202188整整合合到到染染色色体体中中8/5/202189（2 2）牛溶菌酶）牛溶菌酶C2C2在嗜甲醇酵母中的表达在嗜甲醇酵母中的表达作为饲料作为饲料添加剂促添加剂促进反刍动进反刍动物消化。物消化。产量：产量：10L，200h连续发连续发酵产出酵产出50g溶菌酶。溶菌酶。8/5/202190二、昆虫培养细胞表达系统二、昆虫培养细胞表达系统1. 杆状病毒（杆状病毒（Baculovirus）广

41、泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：）侵染周期：两种形式两种形式单独病毒粒子形式单独病毒粒子形式病毒病毒粒子粒子宿主细胞宿主细胞病毒病毒粒子粒子侵染侵染释放释放8/5/202191病毒病毒粒子粒子宿主细胞宿主细胞侵染侵染宿主细胞宿主细胞侵染侵染合成多合成多角体蛋白角体蛋白裂解裂解释放释放多面体溶解多面体溶解一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）多面体形式多面体形式8/5/2

42、02192（2 2）杆状病毒的表达特点）杆状病毒的表达特点感染后感染后36-48h，病毒开始合成大量的，病毒开始合成大量的 多角蛋白。多角蛋白。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白基因可以被替换掉而不影响多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。病毒的繁殖。8/5/202193多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。成多面体。3. 转化子筛选转化子筛选通过显微镜检查看是否有多面体形成。通过显微镜检查看是否有多面体形成。源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，源自

43、草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的多角蛋白的启动子特别活跃启动子特别活跃。2. 最普遍应用的宿主细胞株最普遍应用的宿主细胞株8/5/202194（1 1）转移载体的构建转移载体的构建大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒，插入两段，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。序列以供同源重组。4. 4. 杆状病毒转化载体杆状病毒转化载体杆状病毒的基因组太大（杆状病毒的基因组太大（13kb环状环状DNA），），不能直接插入。不能直接插入。必须使用同源重组的办法。必须使用同源重组的办法。多角蛋白的启动子和终止子及多角蛋白的启动子和终止子及polyA加加尾信号。尾信号。启动子与终止子之间插入多克隆位点启动子与终

44、止子之间插入多克隆位点8/5/2021958/5/202196（2 2）杆状病毒载体转化过程杆状病毒载体转化过程 转移载体中插入外源基因转移载体中插入外源基因 转移载体与野生型转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转共同转染宿主细胞染宿主细胞 转移载体与病毒基因组发生双交换转移载体与病毒基因组发生双交换 外源基因被交换转入病毒基因组中外源基因被交换转入病毒基因组中 重组病毒侵染宿主重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重天后即可收获重组蛋白。组蛋白。8/5/2021978/5/2021984.4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白表达的外源蛋白8/

45、5/2021995. 5. 杆状病毒大规模表达存在的问题杆状病毒大规模表达存在的问题杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为源蛋白，成为“低成本蛋白工厂低成本蛋白工厂”。2222只粉蚊夜蛾幼虫只粉蚊夜蛾幼虫4 4天后表达的人腺苷酸脱氢天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的酶占幼虫总蛋白的2%-5%2%-5%。共产出。共产出9mg9mg很纯的很纯的产物。产物。（1）寿命短）寿命短感染感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。（2）共同转染率低）共同转染率低0.1%-1%。8/5/2021100三、外源基因在植物中表达三、外源

46、基因在植物中表达根瘤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（导质粒（tumor inducing plasmid）。）。1. Ti质粒质粒:8/5/2021101Ti plasmid8/5/2021102环状双链环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相当于细菌染色体的相当于细菌染色体的3%-5%）。）。（1）Ti质粒的结构质粒的结构8/5/2021103 转移转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为合到植物的染色

47、体上。长度一般为12-24kb，是是Ti质粒最重要的部分。质粒最重要的部分。左边界左边界右边界右边界生长素生长素基因基因细胞分裂细胞分裂素基因素基因冠瘿碱冠瘿碱合成基因合成基因T-DNA（transfer-DNA）生长素基因生长素基因:iaaM（tms1）和）和iaaH（tms2）编码合成）编码合成吲哚吲哚乙酸乙酸（植物生长激素）的酶（植物生长激素）的酶iaaM: 色氨酸色氨酸-2-单加氧酶单加氧酶8/5/2021104色氨酸色氨酸-2-单加氧酶单加氧酶色氨酸色氨酸吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺iaaH:吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚吲哚-3-乙酰

48、胺乙酰胺吲哚乙酸吲哚乙酸细胞分裂素基因细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶）：异戊烯转移酶, 催化：催化：二磷酸异戊烯（二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单异戊烯酰嘌呤单磷酸（磷酸（IPA）5-AMP8/5/2021105毒性基因（毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的的转移，转移， 进入和整合进入和整合。vir的产物能诱导的产物能诱导Ti质粒产生质粒产生T-DNA区域的区域的单链拷贝。单链拷贝从单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可质粒脱离后，可与与vir的产物的产物VIR D2蛋白结合，并在蛋白结合，并在VIR D4和和VIR B蛋白

49、的帮助下穿过农杆菌内膜、蛋白的帮助下穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。最后整合到植物染色体上。8/5/2021106章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因： 不相容性基因不相容性基因控制控制Ti质粒的不相容性。质粒的不相容性。冠瘿碱代谢基因冠瘿碱代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。的酶。维持农杆菌生长。8/5/2021107（1）第一步）第一步:植物受伤植物受伤植物受伤后能分泌植物受伤后能分泌酚类化合物酚类化合物（如乙（如乙酰丁香酮、酰丁香酮、 羟基乙

50、酰丁香酮），诱导羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的质粒上的毒性基因表达毒性基因表达。2. 农杆菌的感染和生存农杆菌的感染和生存8/5/2021108（2）第二步）第二步 感染植物感染植物（3）第三步）第三步 毒性基因（毒性基因（vir）表达）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。在茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步）第四步 T-DNA转移转移T-DNA被被vir基因产物切下来，并运送到植基因产物

51、切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步）第五步 诱导冠瘿瘤诱导冠瘿瘤8/5/20211098/5/2021110（6）第六步）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。土壤农杆菌代谢冠瘿碱。8/5/2021111裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物。植物。（1）能够自发地整合到植物的染色体上。）能够自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。）能转化多种植物。（3）强启动子）强启动子3. Ti质粒转化的对象质粒转化的对象4. Ti质粒作为载体的可能性质粒作为载体的可能性T-DNA的冠瘿碱合成酶基因上有

52、一个的冠瘿碱合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。强启动子，能启动外源基因的表达。8/5/2021112（1）分子量太大（）分子量太大（200kb）！）！（2）限制性酶切位点太多。）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。）在大肠杆菌中不能复制。5. 天然天然Ti质粒作载体的缺点质粒作载体的缺点8/5/2021113（4）冠瘿碱合成对于植物无意义，应剔除掉）冠瘿碱合成对于植物无意义，应剔除掉;（5）加入大肠杆菌的加入大肠杆菌的ori和选择标记和选择标记;（6）加上真核生物的）加上真核生物的

53、转录信号转录信号和和结束信号结束信号以以 及及添加添加polyA的信号序列的信号序列。（1）保留）保留T-DNA的转移功能部分（的转移功能部分（vir基因，基因， 左右边界左右边界）;（2）减少限制性酶切位点，引入）减少限制性酶切位点，引入单一插入位单一插入位 点点;（3）取消）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植的致瘤基因，使被转化的植 物细胞不再成为肿瘤，能正常物细胞不再成为肿瘤，能正常分化分化;6. Ti质粒的改造质粒的改造8/5/2021114改造后的改造后的Ti质粒载体模式质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect8/5/20211157. Ti7. Ti

54、载体的类型载体的类型（1）共整合载体（）共整合载体（cointegrate vectors）pGV3850是一种受体质粒，外源基因不能直接插是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于入，而是需要借助于pBR322质粒作为中质粒作为中间载体。间载体。8/5/20211168/5/20211178/5/2021118外源基因外源基因Kanr pBR322土壤农杆菌土壤农杆菌含含pGV3850植物组织植物组织卡那霉素筛选卡那霉素筛选胭脂碱筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素抗卡那霉素的土壤农杆菌的土壤农杆菌外源基因外源基因表达鉴定表达鉴定转化转化插入插入感染感染pBR322与与pGV3850重组重组整

55、合到整合到染色体上染色体上pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，重组。只有这样，土壤农杆菌才能得土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。到抗卡那霉素性状。8/5/20211198/5/2021120（2）双元载体（）双元载体（binary vectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个起点，是个穿梭载体穿梭载体。Ti质粒被剔除了质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢、冠瘿碱代谢基因、基因、vir基因。基因。大幅度减小质粒的体积。（大幅度减小质粒的体积。（10kb）双元载体的结构双元载体的结构8

56、/5/20211218/5/2021122转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。在大肠杆菌里操作。受体农杆菌内要求带有整套受体农杆菌内要求带有整套vir基因基因（但缺失（但缺失T-DNA及左右边界）的及左右边界）的“帮助帮助质粒质粒”提供提供vir产物。产物。1）基因插入）基因插入2）帮助质粒帮助质粒（ helper plasmid）8/5/2021123左左右右外源基因外源基因双元载体双元载体Vir帮助质粒帮助质粒农杆菌农杆菌Vir农杆菌农杆菌左左右右外源基因外源基因感染植物感染植物转化转化左左右右外源基因外源基因进入植物细胞核，进入植物细胞核，整

57、合，表达整合，表达E.coli8/5/2021124（3）三亲融合法）三亲融合法(triparental matig)含双元载体的大肠杆菌：含双元载体的大肠杆菌：含有含有外源基因外源基因和和左右边界左右边界。含有帮助质粒的辅助细菌：含有帮助质粒的辅助细菌：含含vir基因基因。受体农杆菌（空）：受体农杆菌（空）：三种菌混合培养，然后通过各自的抗三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了菌素抗性标记选择吸收了外源基因外源基因、左右界左右界、和、和Vir的农杆菌。的农杆菌。8/5/2021125四、在哺乳动物细胞中表达四、在哺乳动物细胞中表达1.动物细胞基因克隆和表达载体动物细胞基因克隆

58、和表达载体-SV40病毒病毒常用的常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改）改造而来的。造而来的。8/5/2021126 20面体外壳：面体外壳：由由VP1、VP2和和VP3三种病毒外三种病毒外壳蛋白构成。壳蛋白构成。5243bp的环状双链。的环状双链。 DNA：（1） SV40病毒的结构病毒的结构8/5/2021127SV40猿猴细胞猿猴细胞细胞裂解细胞裂解释放释放SV40啮齿类细胞啮齿类细胞细胞癌变细胞癌变SV40DNA整合整合到寄主染色体上到寄主染色体上permissivenonpermissive（2）SV40感染和生存方式感染和生存方式8/5/2021128T-抗原（抗原（tumor antigen）:两个两个6 6聚体的聚体的T T抗原结合在抗原结合在SV40 DNASV40 DNA的复的复制起始点上，分别向相反方向移动，将制起始点上，分别向相反方向移动，将双链双链DNADNA解螺旋。解螺旋。随后单链随后单链DNADNA结合蛋白（结合蛋白（ssBssB）与解开的）与解开的单链单链DNADNA结合维持解旋状态。结合维