液质联用测定牛奶中的氯霉素

1、食品安全评价： 液质联用检测和确认牛奶中的氯霉素Rebecca S. Nicolich a, Eduardo Werneck-Barroso b, Marlice A. Spoli Marques aa Dep Qumica Analtica-IQ/UFRJ, C. Tecnologia, BL A, Ilha do Fundao, 里约热内卢, RJ CEP 219749-970, 巴西b FIOCRUZ-SEFAR/IPEC, Av. 巴西, 4365, Manguinhos, 巴西里约热内卢RJ CEP 21040-900收稿2005年10月18日；修订2006年1月9日；定稿 2006

2、 年 1 月 31 日：在线使用2006年3月9日摘要简单和快速的方法，在牛奶中提取氯霉素 (CAP)和液相色谱分析中提取过程耦合四极串联质谱进行分析。该方法包括使用醋酸乙酯液-液提取，一步酸化的水 (10 mmol L1 甲酸) 和高效液相色谱-质谱/质谱检测。氯霉素被用作内部标准。验证方法根据欧盟委员会2002年/657/EC。校准曲线是线性的典型的 r2 值高于 0.98。牛奶中氯霉素绝对回收率证明是 95%以上， 然而氯霉素-D5d的回收率75%。该方法是准确和可重现正在成功应用于检测从巴西市场获得的牛奶样品中的氯霉素。定量限(CC) 是 0.05ng mL1 和检测限(CC) 是 0

3、.09ng mL1。 2006埃尔塞维尔科学出版社B.V.保留所有的权利。关键词: 氯霉素 ；抗生素 ；食物控制 ；高性能液相色谱串联质谱法 （高效液相色谱法-质谱/质谱)1. 介绍氯霉素 (CAP图1） 是一种广谱抗生素，它能够对人类造成致命的血液疾病。因此，当没有其他替代品可用的时候，才会被应用作为治疗严重感染。然而，在动物中的应用是很有吸引力的，因为动物有良好的耐受性，而且氯霉素在组织和体液中有良好的分布，氯霉素的其他属性对于生产者也很有兴趣。对于渔业来说，这种药物是完美的，由于其长它的半衰期长，在解决方案中 ；其他抗生素四环素类抗生素，比氯霉素而言不够稳定、 应用中需要更大剂量和更频繁

4、的给药。1在巴西，只是最近才禁止将氯霉素用于生产、进口和商业化生产食品的动物2。因此，必须使用其他药物治疗这些动物的感染。在乳牛产奶的特殊个案中，饲料消费和牛奶生产过程中会导致某些疾病的产生， 其中乳腺炎最令人担忧的 3。氯霉素在食品生产中的动物中禁止使用是因为它在食物中有残留物或代谢残留物，不可能建立安全摄取量。联合粮农组织 / 世卫组织食品添加剂专家委员会，考虑到这种物质致命剂量-独立影响的存在，不能确定氯霉素可接受每日摄入量 (ADI)，和最大残留限量 (MRL)。因此，在JECFA 的建议下，不只有巴西，而且美国和欧洲联盟也建立了零容忍食品中的氯霉素残留物。当考虑食物中抗生素残留的影响

5、时，耐药性细菌传播的可能性也非常重要。一般情况下，这些药物会对耐药细菌的繁殖提供一个有利的选择性压力。在兽药中，这类试剂的使用也可能产生这种影响。4结果，在商业化可用的食物中发现这种耐药的细菌表型。5-7尽管在处理食物是可以再它们的菌群中监测到，可是确定这些细菌源还是很困难。8分析兽药在食品中的残留，至少有需要使用的方法： 一个用于筛选和另一个用于确认。必须优化筛选方法，以避免假阴性结果，允许高的采样量和维持低成本。另一方面，必须优化确认方法为了避免假阳性结果 （即，它必须具有高特异性），提供结构说明和数据化的分析 9。图.1.氯霉素（A）和氯霉素-D5（B）结构有可能在文献中找到几个中分析不

6、同食品中的抗生素的色谱方法10-14, 的模型。也有很多分析牛奶中氯霉素 15-19，26，27 的文章。然而，官方的分析数据要求遵守定量的方法的使用和当地卫生机构设立的定量标准。在巴西，普遍采取这种欧洲方法做此类型的分析。在欧洲共同体，分析方法的性能标准是规定由委员会制定2002 / 657 /欧共体 20 。在违禁物质的个案中（第四部分，通过理事会条例90 / 2377 / 21 ，其中包括氯霉素），另一个要求是遵守的最低检出浓度（MRPL）。如今，氯霉素在牛奶中的MRPL是0.3ug kg1 22 。这项研究的主要目的是要建立和推广在牛奶中检测氯霉素的快速创新方法，以液-液萃取和四极矩液

7、质 HPLCMS /MS 检测为基础。这个方法根据委员会决议2002/657/EC进行验证的，应用牛奶分析样本，由巴西卫生监察程序收集的。2. 实验使用下列试剂： 乙腈、 甲醇、乙酸乙酯和甲酸。所有试剂都是高效液相色谱级，生产厂家 (费尔菲尔德，美国)。纯化水由反渗透技术生产(Milli-Q, Millipore)。2.1.标准溶液制备。标准品由以下供应商提供：氯霉素来自美国药典标准(USP、 罗克维尔、 MD、 美国），从氯霉素 D5 (CAP- D5)来自剑桥同位素实验室（美国马萨诸塞州安多弗 CIL）。氯霉素D5 被用作内部标准 (IS)使用。氯霉素以甲醇/水中 (50:50，v: v)

8、 为溶剂配成1mgmL1 的浓度。这些溶液被进一步稀释成适当的浓度作为校正的标准。IS工作溶液用甲醇/水 (50:50、 v: v)配制成在48 ngmL1的浓度。密封， -20 C保存， 避光，时间不得超过 3 个月。2.2.仪器条件 高效液相色谱-质谱/质谱系统由瓦里安 1200L,ESI 能源MS/MS检测器，瓦里安 ProStar 430 MS/MS 自动进样器和瓦里安 ProStar 210 溶液输送系统(瓦里安，Walnut Creek,美国加州)。该探测器是通过调整polypropileneglycol溶液注入速度在20mlmin1，使用注射泵，和优化的解决方案，氯霉素标准溶液0

9、.1 mg ml1（甲醇/水50 : 50，V：V），含有（10mmolL-1甲酸），使用相同的程序。使用瓦里安工作柱（100um20um5um）结合瓦里安metaguard前处理柱获得色谱分离。流动相组成0.1%甲酸水（流动相A）和0.1%甲酸在酸性乙腈（流动相B）进行梯度洗脱（03分钟，5%B；3.5-6分钟，70%B；6.515分钟，5%B），流速0.3mlmin1。自动进样器和柱子温度为232C。质谱仪是使用于正离子质谱/质谱模式（喷雾）。氯霉素和氯霉素D5按下列仪器使用条件及cap-d5：针，3600V，隔膜，600V；毛细管，76v；雾化气体，50Psi；干燥气体，30Psi，30

10、0；载气，氩气，1.80m torr；乘数，2000V；扫描时间，1秒；模拟宽度，0.7amu。图2.典型添加氯霉素0.3 ngmL1 （A 和 B）在空白牛奶样本图谱和添加氯霉素-D5 1.2 ngmL1 (C)。仪器在并联反应监视模式下运行，使用以下参数m/ z323275（定量离子）和m/ z（323 165（氯霉素确认离子）m/ z 328280（氯霉素D5定量离子）；与两个MRM动态检测器碰撞能量为13.5，23.0和11.0v，对于氯霉素和氯霉素D5的检测相对丰富，分别上升到50%（图2）。2.3样品溶液制备2毫升牛奶样品加50ul的IS工作溶液（48 ngml1）混合10秒，经过

11、10分钟的平衡，加水0.8ml水（添加了10mmolL-1甲酸）和4ml乙酸乙酯。提取的样品，10分钟旋转混合器（Fanem， 255B型，Sao Paulo, SP)，400转。之后，他们被离心5分钟3200转时。上清液转移到另一个管，沉降物再用乙酸乙酯提取（不过这次不加水）第二次上清液被添加到第一次上清液中，通氮气，40蒸干。残留物溶解在200ul的混合溶液（水/甲醇，50 : 50，V：V，含10 mmolml1甲酸）和混合20S，提取物注射到LC的体积是50uL。如果是奶粉样品，按照标签说明来复原。用吸量管吸取2ml等量的复原奶。所有样本已被保存在20 C，避光，直到他们被处理。2.4

12、方法验证方法验证使用的实验设计是基于ResVal Versie 2.1提出的CRLBilthoven(RIVM,荷兰), 这是由 Saskia Sterk博士和Henk Herkbold博士提供的信息。一个相同质量的空白池超高温灭菌奶先用酶联免疫吸附试验放射性同位素稀释测定筛选（R-生物制药，达姆施塔特，德国）分为93个子样本，又分为三组31个样本。在不同的日子，每一组31个样品，构建2种刻度线，一个用于计算氯霉素的浓度的准确度和精密度试验（其中应称为“标准曲线”）和其他用于估计CCa和CCb（“控制线”）；因此，用三天时间进行了三个实验。校准线包括六个浓度水平：0.00，0.30，0.45，

13、0.60，1.20和3.00 ngml1氯霉素在牛奶中。为“校准曲线”，各级均一式两份。为“控制曲线”，0.30，0.45和0.60 ngml1准备在六个复制和水平的0.00，1.20和3.00 ngml1不准备复制（只有一个样本准备）。所有样本都有1.20 ngml1 的氯霉素-D5牛奶。该比率最高的区域的不同浓度组分，是计算和绘制一级强化。线性确定线性回归。没有特别的计算校正过程中损失提取的运用（如恢复因子），因为一个是被用来。 精密度和准确度的方法进行了评价结果间的水平0.30，0.45，0.60，1（ngml相当于1信息，1.5信息和2信息）。这评价是通过计算这些上限浓度三个层次的“控

14、制”模式的使用“校准曲线”。图3.氯霉素碎片该方法的特异性的评价分析10不同的空白样品（包括超高温灭菌和奶粉）中为探讨可能干扰洗脱氯霉素的保留时间。此外，这些样品进行了强化一次验证水平（0.30 ngml1）为了调查是否有任何基体效应的量化氯霉素。这量化一个新的校准曲线准备（六个级别一式两份）绝对恢复组分测定比较峰面积从空白牛奶样品添加已知数量的上限（0.30，0.45和0.60 ngml1）和前编写程序，以峰面积由基质提取物尖刺后。六复制进行在每一级。通过比较确定绝对恢复的程序峰值领域从飙升与已知的空白超高温灭菌奶样本帽 (0.30、 0.45 和 0.60 ngmL1） 的金额，是前峰区从

15、矩阵的制备过程中提取它后大幅飙升。在每个级别进行了六个复制。2.5实际样品的应用这些方法适用于确认先前用酶联免疫吸附试验筛选的41个牛奶样品的存在（R-生物科技制药，Darmstadt,，德国）。2004年这些样本与其他一起由当地卫生监督机构从巴西市场获得。色谱/质谱在同一天里对分成两组的样品进行了分析。在牛奶中的氯霉素通过与标准品相同的保留时间进行初步的确认，并通过峰面积的比例来进行定量分析。在给定样本中氯霉素通过比较的相对保留时间怀疑峰值比和相对丰度的主要诊断离子与获得的分析的一个积极的控制（质量控制）。虽然相对丰富的诊断必须没有差异超过20%从这些观察到的质量控制，相对保留时间的峰值出现

16、在怀疑样品必须不相差超过1%的人获得中的质量控制。3结果和讨论。3.1分散模式和色谱法建议诊断离子碎片在图3所示。典型的空白牛奶样品色谱图和氯霉素强化牛奶0.30 ngml1，IS说明图2和图4。这两种物质呈现保留时间7.9分钟并没有色谱峰干扰他们信号。3.2验证研究3.2.1. 特异性质谱分析法是最可靠的技术，用于物质的标识。观察鉴定及其应用点系统介绍了委员会的决定2002/657/EC 允许正确识别与分析物的可能性非常高。有的甚至建议的数学模型表示此技术 23 的置信度。图4.正常的超高温灭菌奶的图谱空白 (A) 和与添加了氯霉素0.3 ngmL1(B)；转化超高温灭菌乳空白(C)与添加氯

17、霉素(D)；再造粉奶空白(E)和添加(F)。商业化的牛奶是从从不同的农场几个奶牛的混合液体，就是一个池。因此，一个样本中独特的内源性化合物会被稀释。既然开发的方法要应用分析超高温灭菌和商业化奶粉，奶粉的来源不是一只动物，来自不同的品牌的奶粉，并在不同状态下进行测试。洗脱下来的色谱峰在不同的保留时间的氯霉素，信号20%以下的氯霉素浓度0.30 ngmL1（图4）。氯霉素的在这些10 个不同空白样本强化在 0.30 ngmL1特异性测试的准确性是100%，这是分析研究在相同的强化水平获得相同的数值。不过，在精密度试验比较这个量化的特异性试验的方差，用F检验，双侧置信水平是0.05。这结果可能表明氯

18、霉素浓度级别的量化存在的一些矩阵效果的影响。3.2.2线性校准曲线准备的浓度范围03.00 ngml1氯霉素在牛奶中。回归分析之间的相关性的色谱峰面积比值（氯霉素/IS）是与已知浓度的分析物产生线性相关的浓度范围。曲线准备的相应的相关系数（R 2）高于0.98。3.2.3精密度和准确度检测和测定的精密度和准确度的方法，评估分析控制样品（0.30，0.45和0.60 ngml1），见表1。根据2002 / 657 /欧共体委员会决定，方法的系数变化（CV）不应超过值的计算霍维茨方程：CV= 2（10.5log），C的质量分数表示功率10。不过，如果质量分数低于1ug.kg1,这个方程则无法接受高

19、的CV值。因此，2002 / 657 /欧共体推荐CV在这种情况下应尽可能低。同时，食品法典委员会的指导方针建议，CV应该低于35% 9 。对于质量分数测试，欧洲法规法典准则规定，准确度应在50120%。如表1所示，在测定和分析精度低于17%，日内和日间精度从82到108%。这些结果表明，该方法有足够的精密度和准确度。表1区域内和区域间精密度和准确度结果性能标准浓度水平（ngml-1）0.30 0.450.60精密度CV(%)分析18.3916.7616.49分析216.268.0016.49分析314.945.8315.54测定13.623.092.76准确度（%）分析1105.5780.5

20、794.43分析2107.7283.4091.98分析383.3383.4489.90测定100.0082.2291.673.2.4。恢复牛奶样品中的氯霉素经过提取程序后的绝对回收率是97.02%（0.30 ng ml1，n=6），98.76%（0.45 ng ml1，n=6），95.04%（0.60 ngml1，n=6），氯霉素-D5绝对回收率 75.07%（1.20 ngml1，n=18）。氯霉素和氯霉素D5存在回收率的差异的可能原因是氯霉素D5五个氢原子替代了氘原子（特别在芳香环）。这种替代可能使氯霉素和矩阵/溶剂分子间产生相互作用力。这些差异可能包括不同极性偶极，偶极子相互作用和质子捐

21、助/质子受体的素质。在气相色谱法，例如，氘化的化合物很少目前较低的保留他们原始的分子比倍。这种现象可以此外能占到分子间的性质和强度的差异类似物之间的相互作用。3.2.5。定量限（CC）和检测限（CC）CC和CC的计算使用校准曲线，它提供了更多重量的低浓度水平（的控制曲线，见2.4节）这种策略使估计的标准偏差的拦截它更能代表的不确定性的那些水平的方程中使用消委会和计算：这一战略允许一个估计的标准偏差的拦截，更具有代表性的不确定性的水平。CC和CC的计算公式：对于每一个控制曲线的构造，CC和CC被计算。（表2）。这些平均值被视为决定限和检测能力的方法：分别是0.05和0.09 ngml1。3.2.

22、6。稳定性在本方法应用于检测牛奶中氯霉素的发展中，它进行了验证，以下实验条件可能对分析结果产生影响：1.流动相酸的浓度。大于0.1%的酸浓度可以在两个阶段使氯霉素的信号不稳定。另一方面，优于 0.1%（0.15 和 0.2%）似乎不影响氯霉素信号，甚至认为他们可能是对分析列是有害的。2.水酸化对液-液提取的影响。水酸化对此步骤 （甲酸在10 mM，ph 5.5）似乎促进氯霉素在乙酸乙酯中的提取，防止其恢复时的变化，验证时用用纯净水来代替。 表2计算CC和CC的方法分析斜率（a）y-截距（b）S截距CCaCCb10.65460.06540.01490.050.0920.7164-0.0780.0

23、1700.060.0930.54550.03800.00990.040.07平均值0.050.09aCC，定量限，是确定样本检出错误的可能性的限度20bCC，检测限，方法是能检出的最小内容，其中一种方法是能与 错误概率来检测，确定和量化分析物 20。3.3.在实际样品中的应用氯霉素未被检测到在任何可疑的样本中。此外这些样品的可能性包括一些假阳性结果，假设改变的基质会对分析中的氯霉素衰减造成影响（这些样本在被捐赠给我们做检测之前已经被避光存储在-20 C中一年了）。这种结果的原因仍然被我们团队进行调查。 尽管如此，众所周知氯霉素是容易被动物和微生物中的酶降解的。一些可能发生的反应的例子包括减少硝

24、基、 酰胺的水解或共轭的羟基24。此外，它已被建议，氯霉素提取在组织均匀化后会立即执行为了防止被分析物与反应内源性酶反应导致损失 25。4.结论高效液相色谱-质谱/质谱用于测定牛奶中的氯霉素，这个先进的方法被证明是有效和可靠的。它在氯霉素定量浓度范围为从0.30到3.00 ngmL1经过验证，能够确认在结果在0.05 ngmL1的错误概率是1%，因此，本方法适合用于控制牛奶中的氯霉素。与其发表在文献中的检测方法相对比，高效液相色谱-质谱/质谱似乎是更简单和便宜26，其中使用亲和层析纯化。虽然 27 具有较低的限制性仅用于奶粉 ；另外一方面，我们也可应用于流体和奶粉。关于实际样品的分析，在结论得

25、出之前有必要进行分析物在基质中的稳定性研究。鸣谢CAPES、 FAPERJ 和 FIOTEC 提供财政支持。INCQS 提供氯霉素标准和真实样本。参考文献：1 Y. Bishop, The Veterinary Formulary, Pharmaceutical Press, USA, 1998(Apud H.M. Ashwin, S.L. Stead, J.C. Taylor, J.R. Startin, S.F. Richmond,V. Homer, T. Bigwood, M. Sharman, Anal. Chim. Acta 529(2005) 103).2 Brazils Mini

26、stry of Agriculture, Normative Instruction No. 38 of 8 ofMay of 2002.3 N. Bareille, F. Beaudeau, S. Billon, A. Robert, P. Faverdin, Livest. Prod.Sci. 83 (2003) 53.4 W. Witte, Science 279 (1998) 996.5 J. Peters, K. Mac, H. Wichmann-Schauer, G. Klein, L. Ellerbroek, Int.J. Food Microb. 88 (2003) 311.6

27、 C.M. Schroeder, D.G. White, B. Gea, Y. Zang, P.F. McDermott, S. Ayers,S. Zhao, J. Meng, Int. J. Food Microbiol. 85 (2003) 197.7 S. Zhao, A.D. Datta, S. Ayers, S. Friedman, R.D. Walker, D.G. White,Int. J. Food Microbiol. 84 (2003) 87.8 M. Acco, F.S. Ferreira, J.A.P. Henriques, E.C. Tondo, Food Micro

28、biol.20 (2003) 489.9 Codex Alimentarius Commission, CAC/GL 16, 1993.10 G. Balizs, A. Hewitt, Anal. Chim. Acta 492 (2003) 105.11 D.G. Kennedy, R.J. McCracken, A. Cannavan, S.A. Hewitt, J. Chromatogr.A 812 (1998) 77.12 W.M.A. Niessen, J. Chromatogr. A 812 (1998) 53.13 F.J. Schenck, P.S. Callery, J. Chromatogr. A 812 (1998) 99.14 B. Shaikh, W.A. Moats, J. Chromatogr. 643 (1993) 369.15 C. Van de Water, N. Haagsma, J. Chromatogr. 566 (1991) 173.16 P.J. Kijak, J. AOAC 77 (1994) 34.17 A.P. Pfenning,