常晓博--鸽传染性法氏囊病病毒分离鉴定

1、 答答 辩辩 人：常晓博人：常晓博 指导老师：何指导老师：何 雷雷 班班 级：动物医学级：动物医学091班班 学学 院：动物科技学院院：动物科技学院河南科技大学本科生毕业论文河南科技大学本科生毕业论文目目 录录n一、研究背景一、研究背景n二、研究目的及意义二、研究目的及意义n三、研究方法三、研究方法n四、研究结果四、研究结果n五、结论五、结论n六、致谢六、致谢一、研究背景n传染性法氏囊病传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病是由传染性法氏囊病病毒毒(IBDV)引起的幼禽的一种急性、高度接触性引起的幼禽的一种急性、高度接触性传染病。传染病。幼禽感染后，可导致免疫抑制，并可幼禽感染后，可导致

2、免疫抑制，并可诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败。诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败。n在在IBD流行地区，鸽子、鹌鹁、麻雀、孔雀等流行地区，鸽子、鹌鹁、麻雀、孔雀等禽类均能自然感染禽类均能自然感染IBDV。n本研究通过对疑似鸽本研究通过对疑似鸽IBDV的法氏囊病料组织的法氏囊病料组织进行了病毒的进行了病毒的分离、培养和鉴定，以便更好地分离、培养和鉴定，以便更好地了解了解IBDV的的感染宿主范围，为感染宿主范围，为IBD流行病学的流行病学的研究及进一步做好研究及进一步做好IBD防制工作提供防制工作提供材料和材料和依依据。据。二、研究目的及意义二、研究目的及意义三、研究方法三、研究方法n 1、IBD

3、V的分离的分离n 2、IBDV的鉴定的鉴定1、IBDV的分离 将将3份份鸽法氏囊病料鸽法氏囊病料组织组织( (编号为编号为H1、H2、H3) )进行进行无菌无菌处理处理，制成组织上清液，制成组织上清液。 将将组织组织上清液上清液通过尿囊腔途径接种于通过尿囊腔途径接种于10日龄的日龄的鸡胚；鸡胚；孵育孵育72h后收获后收获尿囊液。尿囊液。 将收获的尿囊液再次接种于将收获的尿囊液再次接种于10日龄的鸡胚，日龄的鸡胚，72h后再次收获尿囊液。后再次收获尿囊液。 2、IBDV的鉴定的鉴定 以收获的尿囊液为抗原与以收获的尿囊液为抗原与IBDV卵黄抗体进行卵黄抗体进行琼脂扩散沉淀试验。琼脂扩散沉淀试验。

4、提取尿囊液中的提取尿囊液中的RNA，反转录为，反转录为cDNA，以，以cDNA为模板为模板PCR扩增扩增IBDV的基因片段。的基因片段。 运用运用 1%琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，扩增产物，从而对分离的从而对分离的IBDV进行鉴定。进行鉴定。四、研究结果四、研究结果n 1、鸡胚接种结果鸡胚接种结果n 2、琼脂扩散沉淀试验结果、琼脂扩散沉淀试验结果n 3、RT-PCR结果结果1、鸡胚接种结果鸡胚接种结果n分别用分别用H1、H2、H3的组织上清液接种的组织上清液接种10日龄日龄的鸡胚后，孵育的鸡胚后，孵育72h收获尿囊液，每只鸡胚都收获尿囊液，每只鸡胚都收获了收获了6mL

5、左右的尿囊液，且尿囊液清亮，没左右的尿囊液，且尿囊液清亮，没有浑浊现象，说明胚体没有受到细菌等的污染；有浑浊现象，说明胚体没有受到细菌等的污染；与此同时，传代两次胚体都没有死亡现象，接与此同时，传代两次胚体都没有死亡现象，接毒胚和正常鸡胚相比较，胚体大小无差异，也毒胚和正常鸡胚相比较，胚体大小无差异，也没有充血、出血现象，胚体未见明显病变。没有充血、出血现象，胚体未见明显病变。2、琼脂扩散沉淀试验结果n以收获的以收获的3份尿囊液为抗原与份尿囊液为抗原与IBDV卵黄抗体进卵黄抗体进行琼脂扩散沉淀试验，结果显示行琼脂扩散沉淀试验，结果显示3份样品中有份样品中有2份份( (H1、H2) )为阳性，为

6、阳性，1份份( (H3) )样品为阴性。样品为阴性。2份阳性样品的组织上清液及标准阳性抗原份阳性样品的组织上清液及标准阳性抗原与与IBDV卵黄抗体间均出现明显的白色沉淀线，卵黄抗体间均出现明显的白色沉淀线，而阴性样品及对照组未见沉淀线而阴性样品及对照组未见沉淀线，结果见图，结果见图1。 图图1 琼脂扩散沉淀试验结果琼脂扩散沉淀试验结果 1：阳性对照：阳性对照 2-4：分别为样品：分别为样品H1、H2、H3 5-6：阴性对照：阴性对照453 2613、RT-PCR结果结果n3份待检样品的份待检样品的PCR扩增扩增产物经产物经1%琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳之后，泳之后，1、3待检样品待检样品的的P

7、CR扩增产物在约扩增产物在约700bp的位置上出现了特的位置上出现了特异性条带，与预期片断异性条带，与预期片断大小相符，而大小相符，而2号孔内的号孔内的PCR扩增产物没有出现扩增产物没有出现目的条带。结果表明目的条带。结果表明3份份待检样品有待检样品有2份为阳性，份为阳性，1份为阴性。结果见图份为阴性。结果见图2。图2 3个IBDV毒株VP2的PCR扩增产物 M: MakerDL5000 N:阴性对照1-3:待检样品 H1、H3、H2的PCR扩增产物 2 M 31N五、结论五、结论n本研究通过琼脂扩散沉淀试验和本研究通过琼脂扩散沉淀试验和RT-PCR试验共同证明了试验共同证明了3份份鸽法氏囊病料组织鸽法氏囊病料组织有有2份份(H1、H2)为阳性，为阳性，1份份(H3)为阴性，为阴性，说明本研究成功地分离到了鸽源说明本研究成功地分离到了鸽源IBDV。六、致谢六、致谢n感谢何雷感谢何雷老师老师对本论文给予的细心指导和莫大对本论文给予的细心指导和莫大的支持！感谢余宁师兄、马芳师姐的支持！感谢余宁师兄、马芳师姐、张淼丹师张淼丹师姐、张俊峰师兄及陈松彪同学在我实验操作过姐、张俊峰师兄及陈松彪同学在我实验操作过程