这些免疫共沉淀实战技巧,师兄师姐一定不会告诉你

1、这些免疫共沉淀实战技巧，师兄师姐一定不会告诉你最近 WB 的结果趋势不是很理想， 因为给了蛋白 B 的 抑制剂蛋白 B 却没有明显变化。于是大伙儿一合计，可能 需要再看看蛋白质之间的相互作用，会不会是抑制剂影响了 蛋白 B 和蛋白 C 之间的结合，而不是直接导致蛋白 B 的 降解。大家都知道研究蛋白质相互作用的三大经典方法是： 酵母双杂交（丫2 H ），免疫共沉淀（CoIP ）和GST pulldown。 结合我们课题组的这个实验， 因为只需看看蛋白 B 和 C 之 间的结合， 而且已知蛋白 B 和 C 是会结合的， 所以可能用 CoIP 最简便。那么问题来了， 实验室里也没人做过 CoIP

2、啊， 我自己也是头一回接触这个实验，心里不免瑟瑟发抖。但是 探索才是科研路上最大的乐趣，还记得上次的文章没有师 兄疼 , 没有师姐爱 , 我的实验该怎么办 ?，那可不是说说而 已，这次我们就来实战演练一下，看看是如何从0 开始做CoIP 的。首先我们得了解一下 CoIP 的原理，其实和 WB 一样，就是抗体抗原结合的免疫反应，只要你会WB ，就能轻松理解 IP 和 CoIP 的原理。简单来说，如果蛋白 B 和 蛋白 C 结合的话， 那么用抗体去结合蛋白 B 的时候，蛋白 C 就能被拉下来。大家知道抗体的结构是一个 丫 字形，两头是 Fab 用于识别 抗原，尾巴是 Fc 区域，这个 Fc 区域就

3、能结合 Protein A 或 G 。自从磁珠出现之后， CoIP 的操作就变得更加简单了， 只需要用包被 Protein A 或 G 的磁珠先和抗体结合，然后 用抗体磁珠复合体去结合蛋白 B ，之后再用 PAGE 胶分离， 用 WB 检测就 OK 了。除了研究蛋白质相互作用，同样的 原理，还可以用来研究核转录因子，有了这样的实验，必定 为文章增色不少。那么知道了原理，我们可以先在网上找几 个视频看看，从视频中我们知道了 CoIP 的原理，以及做 CoIP 都需要什么，那么我们就动手准备吧。磁力架这个东 西其实很简单， 如果有钱的话建议直接买 CoIP 试剂盒， 一 般是会送磁力架的，如果没钱

4、那就 DIY 一个吧。先从网上 下载一个磁力架的 3D 文件，送某宝 3D 打印出来，再买 点小磁铁装进去就 ok 了，下图是效果图。然后从实验室找 到一个老式的 DNA 混合仪，用热熔胶粘一块浮漂板上去， 这样 EP 管混合器就搞定了。 至于磁珠， 因为周围的代理商 很少卖这个东西， 都不甚了解， 于是去丁香通看看， 搜索 IP 磁珠，正好看见第一个是金牌供应商， 点击一下联系厂家， 不久厂家来电，先不着急下单，可以问问这个实验相关的问 题，然后问问有没有试用装，索要一点试用装先试试。至于 ProteinA 和 G 如何选择需要看你的抗体是什么类别， 有的 和 A 结合能力强， 有的和 G

5、结合能力强， 比如抗体来源是 mouse IgG2b ，选 A 或 G 的磁珠都可以。 过了几天， 磁珠 到手了， 根据说明书配置了三种 pH 不同的缓冲液， 都是常规试剂， 配完之后用盐酸滴定一下 pH 就 ok 了。接下来按 照说明书的步骤操作就可以了。但开始之前我们还需要看看 CoIP 的对照组怎么设置，如果没有对照，跑出来的条带也 不知道是不是我们想要的结果啊。这里隆重给大家推荐一个 来自 NIH 的神器： Openi 。貌似知道的同学还不多。 这个网 站可以直接搜索论文里的图片，比一篇篇去找文献方便多了。 于是我们搜索 CoIP ，得到很多的结果，随便找几个看看 就知道该如何设置对照了。这样万事具备之后我们就开始吧， 提蛋白，制作磁珠抗体复合物，然后CoIP ， SDS-PAGE ，再 WB 检测，抗体孵育过夜。第二天结果出来了，效果很 明显，原来蛋白 B 的抑制剂间接促进了蛋白 B 和蛋白 C 的结合，有了这样的结果，文章档次