集成多通道SPR生物传感芯片生物敏感膜研究课件

1、2120060249集成多通道SPR生物传感芯片2009526微电子学与固体电子学电子科学与技术刘国华 教授李智梁信息技术科学学院生物敏感膜研究南 开 大 学硕 士 研 究 生 毕 业（学 位）论 文姓 名 李 智 梁年 级 二零零六 级专 业 微电子学与固体电子学研究方向 传感技术与智能系统论文题目 集成多通道SPR生物传感芯片生物敏感膜研究完成日期 二零零九年 五月导 师 刘国华 教授二 零 零 九 年 五 月南开大学学位论文使用授权书根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。本人完全了解南开大学有关研究

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4、李智梁学号2120060249答辩日期2009年 5月 24日论文类别博士 学历硕士 硕士专业学位 高校教师 同等学力硕士院/系/所信息技术科学学院专业微电子学与固体电子学联系电maildeserteagle.lzl通信地址(邮编)：山西省寿阳县陵园东巷44号（045400）备注：是否批准为非公开论文否注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写(一式两份)签字后交校图书馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引

5、用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何其他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：年 月摘要摘要本文的研究工作是国家自然科学基金项目“集成多通道SPR生物传感芯片及其对IgE的检测分析”的一部分工作。集成多通道SPR生物传感器是对原有SPR生物传感器的进一步改进，它克服了原有单通道的SPR传感器实验周期过长、仪器体积庞大等缺陷。通过使用多组二元光学器件，为多个通道提供了各个角度的入射光，利用电控平移台在两个坐标方向上的扫描，获得了各个通道的共振角

6、度信息。大大提高了实验的检测通量，缩短了实验周期，同时也体现了系统集成化的特点。本文重点研究了传感器前端的生物敏感膜。首先比较研究了固定蛋白质探针分子的方法，一种是以葡聚糖凝胶为媒介的方法，另一种是以组氨酸侧链和金属离子为媒介的方法。提出了使用多种巯基烷酸的混合溶液固定蛋白质分子的方法。分析了以上固定方法各自的优缺点以及敏感膜重复利用的方法，即使用甘氨酸缓冲液、咪唑缓冲液、酸、碱等解离探针分子。之后提出了在金膜上固定蛋白质分子方法的有效性的验证方法，即利用酶作为标记的方法。由于酶的本质是蛋白质，所以首先用待验证的方法固定酶，洗净之后加入酶催化反应的底物溶液，如果金膜上成功固定了酶，底物就会发生

7、反应，造成光学性质的改变，通过测量溶液在特定波长下的吸收性质来确定酶的存在与否，进而确定蛋白质固定方法的有效性。由于酶量与反应产物的量直接相关，这一方法甚至可以定量比较各种固定方法的优劣。本文分析了待测物浓度测量的原理与方法，对实验中可能产生的误差做了细致的分析。之后使用经过验证的蛋白质固定方法固定了抗抗体探针分子，测量了抗体分子加入之后的响应。最后提出了系统改进的方向。关键字：表面等离子共振传感器 蛋白质固定 验证蛋白质固定方法 酶催化反应64AbstractAbstractIntegrated SPR bio-sensor with multi-channel overcomes the

8、disadvantages of traditional SPR sensor with single-channel, since it can shorten the experimental period and simplify the instruments. By using the binary optical element, incident light beam with various angles is provided for each channel to excite the SPW. Scanning the channels in two dimensions

9、, the resonant angle for each channel can be obtained. Thus it can increase the throughput of the system significantly and integrate the system.This thesis focused on the sensing film of the sensor. At first, two immobilizing methods were introduced: one with dextran as medium and another with Histi

10、dine and metal ion as medium. The advantages and disadvantages of the two methods, together with the reuse of the film are analyzed. Then a simple way to validate the efficiency of immobilization of proteins on gold surface in SPR sensor is introduced. This method used the enzyme as a flag, if a met

11、hod can immobilize proteins, it can also immobilize enzyme. The HRP was used in this case, and it is a catalyst of the reaction of the TMB and H2O2. The HRP linked gold surface is treated with the solution of TMB and H2O2. The spectrum of the solution can tell whether the enzyme is successfully immo

12、bilized and whether that method can effectively immobilize proteins. Terminate the reaction with HCl, there will be a peak at 450nm if the HRP is indeed immobilized. This validation method can even compare quantitatively between the immobilizing methods. One immobilizing method was tested in this wa

13、y. Anti-IgG was immobilized with this tested method, and the result was satisfied after the IgG was combined. Key Words: surface plasmon resonance sensor，immobilizing proteins，validation for immobilizing proteins，enzyme reaction目录目录第一章前言1第一节 SPR技术的发展与现状11.1.1 光纤SPR和波导SPR21.1.2 硅材料的SPR31.1.3 多分析物SPR4

14、第二节 多通道SPR系统构成51.2.1 光学器件51.2.2电路系统51.2.3 桌面软件6第三节 本文的研究内容与创新点81.3.1 本文的研究内容81.3.2 本文的创新点10第二章 蛋白质分子固定11第一节 金膜制备11第二节 固定方法比较研究112.2.1 水凝胶媒介法122.2.2 金属离子媒介法162.2.3 固定方法优缺点23第三节 敏感膜重复利用262.3.1 重复利用的原理262.3.2 实验操作28第三章 蛋白质固定方法有效性验证29第一节 验证方法比较研究293.1.1 显色反应293.1.2 紫外分光光度法313.1.3 酶联免疫吸附法323.1.4 快速斑点渗滤法3

15、4第二节 酶标抗体标记法363.2.1 酶标抗体标记法原理363.2.2 实验步骤373.2.3 实验结果393.2.4 结果分析41第四章 SPR传感系统定量检测研究42第一节 确定速率常数424.1.1 基本思路424.1.2 平衡常数454.1.3 化学计量数464.1.4 动力学分析47第二节 浓度分析48第五章 免疫球蛋白检测49第一节 抗原49第二节 抗体505.2.1抗体的结构505.2.2 单克隆抗体52第三节 实验步骤53第四节 实验结果54第五节 结果分析55第六章 总结与展望56第一节 系统性能总结56第二节 系统改进的方向57参考文献58致谢62个人简历63第一章 前言

16、第一章前言第一节 SPR技术的发展与现状图1.1 Kretchmann结构20世纪早期，Wood观测到了偏振光照射到金属光栅上时激发的表面等离子共振现象1，这一现象被认为是偏振光的光子与金属中的自由电子发生了谐振耦合而引起的，在这个过程中，金属与其他介质接触面的电磁性质决定了表面等离子体波（Surface Plasmon Wave, SPW）的产生，表面等离子体波沿着金属表面传播并逐渐消散。这一现象立即被广泛用于金属薄膜的研究中，大量的先驱工作致力于描述表面等离子共振现象，Ritchie等人2（1968）、Raether3（1988）、Nylander等人4（1982）首先将其应用于传感器领域

17、。这一技术被用于确定特异性结合的分子间的亲合力、反应的动力学性质、浓度分析5等方面，可以实时地定性、定量分析待测物，省去了荧光标记的麻烦。之后一段时间内各种结构的SPR传感器陆续出现68，如耦连到棱镜的Kretchmann结构（图1.1）等。最近的研究致力于发展集成度高、低成本、可重复利用、灵敏度高的传感器。表面等离子体共振传感器正在越来越广泛地被应用于生命科学的基础研究、保健科学研究、药物研制、临床诊断、环境和农业监测等方面9。制造工艺的飞速发展使得更多的光电器件被应用于SPR研究中，而纳米技术的进步也促进了传感器敏感膜的更新换代。这些最新的研究工作正在逐步将SPR技术推进到片上实验室（la

18、b-on-a-chip）的新阶段。SPR传感器的检测原理基于共振角度的改变，目标分析物与敏感膜表面上的生物受体结合时，光耦合产生表面等离子体波的条件发生了改变，造成了共振角度的改变（图1.2）。目前市售的SPR仪器可以检测到1 pg/mm2的目标分析物吸附量，灵敏度一般被表示为折射率的变化量（Refractive Index Unit, RIU），这样表示的仪器的灵敏度为110-5110-6 RIU。当今SPR传感器发展的重要方向之一就在于灵敏度的提高。SPR技术最近的三项重大突破是光纤SPR和波导SPR（fiber- and waveguide-SPR）、硅材料的SPR（SPR on sil

19、icon material）、多分析物SPR系统（multi-analyte SPR system）。图1.2 受体-配体结合后共振角改变1.1.1 光纤SPR和波导SPR传统的棱镜耦合结构的传感系统在过去几年中应用非常广泛，但它存在不易小型化和集成化的缺点。光纤和波导SPR被认为是棱镜耦合结构的替代品。光纤是激发表面等离子体波的理想介质，它由一个高折射率的芯和覆盖层组成。早期的光纤SPR传感器由抛光的光纤尖端外包金属层构成（如图1.3(a)）。这样的传感器可以检测气体或者生物分子1012，可以从光纤反射回来的光或者从金属另一侧衍射的光中测量共振角等信息。Kurihara等人13证实使用微制造

20、工艺将光纤的尖端蚀刻成圆锥状（如图1.3(b)）可以增强光耦合作用，并达到810-4 RIU的灵敏度。当使用不同波长的激光作为光源时，圆锥的最佳角度也不一样，使用近红外区的激光可以获得10-5 RIU级别的灵敏度 14。Piliarik等人15的研究工作则将注意力放在使用可以维持光的偏振性的光纤来进行更精确的测量，并且获得了410-6 RIU的灵敏度。图1.3 三种光纤SPR图1.4 波导SPR光纤SPR的替代品是波导SPR（图1.4）。Ctyroky等人在这方面做了大量的理论工作16,17。最近的研究工作聚焦于设计多模式波导18，用两种TM偏振模式的光来激发表面等离子体波，可以获得膜厚度、敏

21、感膜折射率等方面的信息，并取得410-3 RIU的灵敏度。Wang等人19使用脊状波导、双偏振光进行了研究。首先通过热离子交换在玻璃基质上形成一层通道，这一层的折射率比玻璃基质高，然后玻璃基质被蚀刻掉一部分，形成脊状波导。在脊的上表面和侧面镀上金属薄膜，使用TM模式的偏振光在上表面激发表面等离子体波，而使用TE偏振光在侧面激发表面等离子体波，利用这两个正交的偏振光就可以从两个表面上得到许多有用的信息。波导SPR的优势在于它能通过微操作技术将多个敏感单元集中在一个基片上，并呈阵列分布。使用波分复用光通信技术（Wavelength Division Multiplexing optical com

22、munication）可以从不同的敏感单元中提取各自的信息20。如果将信号叠加到统一的基准信号，可以消除测量环境的微弱改变带来的影响，如温度改变、噪声的影响21。波导SPR不仅可以阵列化，而且可以做成多层结构，例如在两层波导间设置绝缘层，做成对称结构22，可以进行更高通量的检测。这种结构激发的表面等离子体波传播得更远，共振角波形更加尖锐23，24，被称为LRSPR（long-range surface Plasmon resonance）。1.1.2 硅材料的SPR另一项有效促进了SPR系统集成化的技术是使用半导体作为SPR的基质。传统的光栅型的SPR系统比较精简，但要求激光和反射光从样品中透

23、过（图图1.5 光栅结构的SPR1.5），这就给系统带来了噪声25，26。如果在肖特基半导体器件上设计银栅，同样可以激发表面等离子体波。表面等离子体波产生了电子-空穴对，可以通过测量肖特基势垒两侧的电势差来定性甚至定量电子-空穴对。利用这一原理，系统可以达到1210-5 RIU的灵敏度。波长在红外波段的光源能够在硅棱镜表面激发表面等离子体波，并且比玻璃棱镜条件下穿透深度更大，共振角度更集中。由于硅可以很方便地被微加工，因此对于SPR系统的小型化非常有利。Tsuijiuchi等人27利用各向异性湿蚀刻技术在硅上蚀刻了微棱镜阵列，并且安装在微型机械臂上，通过电力控制机械臂使得入射的激光能从各个角度

24、扫描棱镜。虽然这一设计的灵敏度还不够高，但它对实现大规模集成化非常有意义。1.1.3 多分析物SPR高通量的分析要求系统能够同时分析多个靶分析物。许多情况下，待测对象的浓度非常低，再加上遗传因素和个体差异，同时检测多种待测物的技术对精确诊断就显得相当重要。如在药物发现过程中，成千上万的分子需要被筛选；而快速诊断过程同样要求识别多个标记物，这些应用都是这一需求的实际体现。虽然波导技术也可以构造并行的通道和敏感单元28，但使用微图案技术可以替代它实现更大规模的多分析物检测。目前存在多种微图案技术，如微流通道印迹29（microfluidic channel stamps）、微接触印刷30（micr

25、o-contact printing）、紫外解吸31，32（UV desorption）、光氧化（photo-oxidation）、光分解33（photolysis）、电聚合34（electro-copolymerization）等。综上所述，高效的光源和光电检测设备、波导、喷射模塑法、自组装技术35，36、微流系统37、纳米制造技术等一系列技术手段的发展推动了SPR生物传感器的集成，加上数学建模工具的出现、数据分析算法的改进3842、可以激发表面等离子体波的新材料的应用，可以预见SPR生物传感器在未来几年的飞速进步。纳米技术的发展使敏感膜等呈现新的特性，推动了LSPR的发展。在不久的将来，可

26、以实现由用户订制功能的专用传感器。SPR传感器越来越成为生物分子分析和医学诊断的重要工具。第二节 多通道SPR系统构成本实验所使用的多通道SPR系统具有以下几个基本部分：光学器件、电路系统、桌面软件。完全可以使用模块化的设计方法来实现各个部分。1.2.1 光学器件这部分的基本结构如图1.6所示，它由光源、三棱镜、四个小凸透镜组成。四个小凸透镜被粘在图中虚线标出的焦点正下方的三棱镜表面，分别用O1、O2代表。O1、O2的焦距不同，图中标出的是两组透镜形成的双通道光路，如果将光源沿着垂直于纸面的方向平移，则可以实现阵列形式的检测，大大提高检测的通量。光线入射以后，在三棱镜的左肩上被反射回来，聚焦于

27、N1、N2处，由于光线是聚集形式入射，所以可以提供各个角度的入射光，省去了传统SPR系统中需要移动单光源来实现各个角度入射的麻烦。N1、N2处的反射光经三棱镜右肩反射，再经O1、O2修正为平行光，提供给电路系统中的光敏元件检测。图1.6 多通道SPR系统的光路原理1.2.2电路系统电路系统由电控平移台、蠕动泵、光电二极管阵列、MSP430F169（单片机）、TMS320C5410（DSP）、EPM3032A（CPLD）几大部分构成（图1.7）。其基本工作原理是：在电控平移台上固定的光电二极管阵列模块可以检测各个通道的光学信号，并转换为模拟信号输出给单片机MSP430F169的ADC模块。单片机

28、将光电二极管的1024个感应单元的模拟信号转换为数字信号，通过HPI接口传送给DSP芯片TMS320C5410，DSP完成这1024个数字信号的三次样条插值计算，得到共振角度，并通过HPI接口回传给单片机。单片机接收到共振角度之后通过RS-232接口向PC发送数据。DSP的程序存储在外置Flash芯片中，由CPLD芯片EPM3032A为Flash提供时序实现对Flash的读写操作。单片机MSP430F169同时还具有控制蠕动泵的功能。图1.7 电路系统结构框图1.2.3 桌面软件软件系统由两部分构成：在线工作站和离线工作站。前者负责控制传感芯片的数据采集处理以及接收传感芯片采集到的数据，离线工

29、作站负责对保存好的数据进行分析处理。在线部分（图1.8）的主要功能包括通道选择、参数设置、采集开始及停止控制等。用户可以根据实际情况填写实验标题、实验人姓名、实验参数等信息（图1.9）。设置完成后用户可以开始采集数据，根据需要选择“单次采集”、“连续采集”。采集到的数据会以曲线图的形式显示在对话框中。这部分软件需要通过串口与电路系统通信，按照规定格式给下位机发送命令，并且从串口接收到的数据中提取需要的信息。为此制订了串行通信协议，包括数据帧、数据握手帧、命令帧、命令握手帧、消息帧的格式以及通信流程。软件部分使用了MFC的MSCOMM控件。在数据保存模块中，利用了MFC的文档串行化机制，将数据保

30、存在计算机硬盘上，这样做的好处是可以省略第三方的数据库软件的支持，简化了应用程序的结构。图1.8 在线工作站对话框离线部分对话框结构如图1.10所示。用户可以使用“打开”按钮来选择打开之前已经保存好的SPR文件，并且可以绘制多幅图来实现多次实验数据的相互对比。用户还可以根据需要将图形中的任一区域放大观察，之后可以还原图像。图1.9 设置实验参数图1.10 离线工作站对话框第三节 本文的研究内容与创新点1.3.1 本文的研究内容本文系统地研究了SPR生物传感系统前端的构成，这是决定传感器性能的重要部分，它主要包括金属薄膜、生物敏感膜两大部分。金属薄膜固定在传感系统的光学器件上，它提供了产生表面等

31、离子体共振现象的必要条件。金属薄膜之上是生物敏感膜，膜上固定着探针分子，可以特异性、选择性地与待测溶液中的目标分子发生结合。通过观测配体和受体结合过程中的共振角度的变化，得到待测溶液中的信息，定性、定量目标分子以及获得结合反应本身的一些数据。第一章介绍了SPR技术的发展与现状以及实验中用到的多通道SPR生物传感芯片的构成。首先介绍了光纤SPR和波导SPR、硅材料的SPR、多分析物SPR的技术原理和发展情况。接着介绍了多通道SPR生物传感芯片的光学器件、电路系统、桌面软件。按照自顶向下、逐步细化的思路分别实现各个部分的功能，再组装起来调试，得到了最终的实验系统。本文第二章首先介绍了金属薄膜的两种

32、制备方法：溅射法和湿化学制备法。之后详细讲述并比较了生物敏感膜的构造和制备方法，对水凝胶媒介法和金属离子媒介法的实验具体操作、优缺点进行了深入研究。提出了使用不同长度碳链的巯基烷酸的混合溶液固定蛋白质分子的方法，巯基端可以使分子自组装在金膜表面，羧基端可以用于共价固定蛋白质分子。这一方法可以简化实验步骤，缩短实验周期，节省成本。可以使用第三章介绍的方法测试这一方法固定探针分子的有效性。之后研究了敏感膜的重复利用问题，这对于提高SPR传感器的实用性是非常重要的环节。第三章详细探讨了在金属薄膜上固定蛋白质分子方法有效性的验证过程。首先比较了几种蛋白质分子检测的方法，指出了它们各自存在的不足之处。之

33、后提出了利用酶作为标记物的验证方法，其基本思想是：生物体内的酶是高效的催化剂，它的本质是蛋白质。如果某种方法确实能在金属薄膜表面固定蛋白质分子，那么利用这种方法也一定能固定酶。之后将可能固定了酶的金属薄膜表面置于酶催化反应的底物溶液中。由于极少量的酶就可以催化大量的底物发生反应，利用反应产物的特殊光学性质进行检测，即可判断是否成功固定了酶，达到验证固定方法的有效性的目的。这一研究工作已发表在传感技术学报2008年9月第21卷第9期当中。第四章研究了SPR系统的定量检测原理。首先分析了配体与受体结合速率常数与解离速率常数的测量原理和测量方法，得到这两个数据以后就可以用于计算待测溶液中含有的受体（

34、或配体）的浓度。第五章介绍了抗原的性质，抗原、抗体特异性相互作用的原理，抗体的空间构象、分子构成，单克隆抗体制备的原理，以及利用前述方法定性定量检测蛋白质（人IgG）的过程。第六章总结了系统的各项性能，并且提出了系统改进的一些建议。1.3.2 本文的创新点本文的创新之处体现在：1提出了利用不同长度烷烃链的巯基烷酸固定蛋白质分子的方法，这一方法结合了水凝胶媒介法和金属离子媒介法的优点，具有相当突出的优势。2提出了在金属薄膜表面固定蛋白质分子方法的有效性的验证途径。验证方法巧妙地利用了酶反应的快速、准确、微量的特征。使用酶作为标记物，通过检测酶催化反应产物的性质来间接检测酶的存在与否，达到了预期的

35、目的。这一技术创新被传感技术学报收录，发表在该刊物2008年9月第21卷第9期当中。3提出了计算待测溶液中目标受体（或配体）分子的浓度的方法。第二章 蛋白质分子固定第二章 蛋白质分子固定第一节 金膜制备表面等离子体共振传感器使用的金属薄膜材料可以有许多种，最常用的是金、银等。银作为金属薄膜时灵敏度最高，但是由于银的稳定性差，容易被氧化。金的稳定性相当好，因此选择金作为制备金属薄膜的材料。实际操作中既可以将金直接镀在棱镜底，也可以镀在与棱镜材质一样的薄片上。如果使用薄片，还需要在薄片和棱镜之间设置折射率匹配液实现二者的耦合。本实验为了操作方便，将金直接镀在棱镜底上。制备金属薄膜的方法有溅射、真空

36、热蒸发、湿化学43等方法。溅射法的原理是用加速后的离子轰击金属靶，离子和金属表面的原子交换能量后，金属就会从固体表面溅射出来，在目标物表面形成金膜。由于金与玻璃的附着力较差，如果采用溅射法制备金膜，首先需要在玻璃上附着薄薄的一层铬，以提高金的附着力。湿化学法制备金膜：用铬酸洗液浸泡棱镜欲镀金的表面过夜，在70的体积比为3：1的浓H2SO4/30%H2O2混合溶液中浸泡10到30分钟，用去离子水和光谱纯甲醇漂洗干净，浸入含有0.8 ml氨基丙基三甲氧基硅烷的8 ml甲醇溶液中进行玻片硅烷化处理1218小时，用甲醇洗净，立即浸入柠檬酸钠还原法制备的平均颗粒直径约为2到3纳米的金溶胶中组装1218小

37、时，用水洗净后浸入48 ml的镀金液中（含浓度为0.11 mM的羟氨和浓度为0.050.15%的氯金酸），均匀摇动10分钟左右，可获得厚度在4560 nm间的金膜。本实验选择了溅射法作为制备金膜的方法，采用磁控溅射的方法先后在柱面棱镜的底面制备厚度为2 nm的铬膜和厚度为50 nm的金膜。第二节 固定方法比较研究如前所述，在日臻完善的生物传感器技术领域中，基于光学原理的表面等离子体共振传感器在免疫诊断以及探究生物分子性质的研究方面显示出了相当巨大的潜力4447。通过固定特异性生物分子对（bio-specific pair）中的一个组成部分，例如抗原（antigen）或抗体（antibody），

38、然后加入含有另一个组成部分的待测溶液，观测特异性分子（如抗原和抗体）之间结合、分离过程中的光学指标（共振角）的变化，使得这项技术可以用于研究、测量溶液中待测物质的浓度，以及描述特定反应的动力学性质（如结合、解离常数，反应的平衡常数等）、分子之间特异性结合的亲合力研究等。固定蛋白质分子到敏感膜上的方法有许多种，其中具有代表性的有：2.2.1 水凝胶媒介法Stefan Lofas和Bo Johnsson等人的研究表明用水凝胶修饰的金膜可以提供一个活泼的、具有大量活性位点的激活表面，可以用于一系列的生物化学分析研究过程中。以往描述表面等离子体共振生物传感器固定生物分子方法的文章中，抗原或抗体在检测之

39、前只是简单地直接被吸附在金属薄膜表面。虽然这一方法也明显地体现出了表面等离子体共振现象，但是这种最直接简单的方法有许多局限性：首先，蛋白质分子与金属直接结合可能发生变性。蛋白质分子变性后，其分子结构的一级结构（即肽链中的氨基酸分子顺序）不会发生变化。但是蛋白质分子的二级以上结构会发生破坏，这一变化是由于维持蛋白质分子二级结构的氢键、疏水的相互作用、范德华力、离子键和配位键发生了破坏，使得其分子中不同的肽链之间的相互作用发生了变化，造成的结果就是整个蛋白质分子的空间构象发生变化，原来集中在一起的活性中心分子发生偏移，使蛋白质分子的生物活性丧失。由于抗原、抗体的结合是依靠抗体针对特定抗原的抗原决定

40、簇来实现二者的特异性结合，如果抗原决定簇的活性中心分子发生了偏移，就会造成原本会发生特异性结合的抗原-抗体不再相互结合，固定上去的蛋白质分子层（如抗抗体）无法吸附抗体，影响了实验的精度，甚至会出现完全错误的结论。此外，要固定半抗原类型的配体到金属薄膜表面也是一件相当困难的事情。第二，既然表面等离子体共振现象是基于金属-溶液交接处的介电常数的变化来实现观测的，分子的非特异性结合必须控制在最小的水平。由于吸附是物理性吸附，没有任何特异性，这就有可能发生不需要的分子结合到金属薄膜表面，或者溶质分子与原本已经结合上去的配体发生交换而将配体置换下来，溶质却结合在了薄膜表面48。这两种情况的发生会给实验带

41、来极大的误差。综上所述，理想的解决办法是提供一个稳定的、可以共价结合配体的、可重复利用的、可以最大程度暴露配体的活性中心给溶液的表面。这样才能实现配体与特异性分子的可靠结合，保证实验的精确。以下将要讨论的是一种将水凝胶修饰在金属薄膜表面上的方法，这一方法克服了上述方法的缺陷，提供了一个适合于快速、简单地共价结合蛋白质或其他配体并可再生利用的途径。这种经过修饰的敏感膜的应用范围很广泛，特别适合于生物分子特异性结合反应的分析。金属表面的修饰层是由一层起隔离、屏蔽金属性质作用的分子层和一层可以共价结合抗原或抗体的羧甲基化的右旋糖苷水凝胶分子层组成。由于用于表面等离子体共振现象的金、银的化学性质比较稳

42、定，不易发生化学反应，所以要引进一个分子层来隔离、屏蔽掉金属层的惰性，能够胜任这一工作的分子是硫醇分子。硫醇分子中的巯基能与金形成金硫键，使硫醇分子吸附在金属薄膜表面。通过自组装作用，首先在金属薄膜表面自组装一层长链的硫醇49,50（例如1, -hydroxyalkyl thiols），形成一层亲水性的分子。长链的硫醇分子有效地屏蔽掉了金属层对蛋白质分子的作用，同时分子中与巯基相反的一端可以提供进一步化学反应的基团。本方法中，利用表氯醇（epichlorohydrin）与硫醇单分子层中的羟基形成了环氧化物（epoxide），再将右旋糖苷水凝胶共价固定在这个环氧化物上，通过这一途径，长链的、高分

43、子的右旋糖苷分子层就被固定在了金属薄膜的表面，可以用于不同的检测目的。 实验流程实验名称：利用水凝胶媒介法固定蛋白质分子。试剂清单：（1）16-mercapto-hexadecan-1-ol，配成溶液的浓度为510-3 mol dm-3。（2）乙醇。（3）epichlorohydrin（表氯醇），浓度0.6 mol dm-3。（4）diglyme（二甘醇二甲醚）。（5）氢氧化钠。（6）dextran（右旋糖苷）。（7）bromoacetic acid（溴乙酸），浓度1 mol dm-3。（8）N-乙基-N-(3-二甲氨基丙基)二亚胺氢氯化钠，浓度0.2 mol dm-3。（9）N

44、-羟基琥珀酰亚胺，浓度0.05 mol dm-3。（10）monoclonal antibody（单克隆抗体），浓度60 g cm-3。（11）乙酸钠，浓度1010-3 mol dm-3。（12）乙醇胺，浓度1 mol dm-3。（13）glycine（甘氨酸）。实验过程：（1）自组装。将镀有金膜的棱镜放置于浓度为510-3 mol dm-3的16-巯基-1-羟基十六烷（16-mercapto-hexadecan-1-ol）的乙醇溶液（乙醇和水的体积比为80：20）中，将巯基十六烷醇自组装在金膜表面。（2）形成环氧化物。在25下使用浓度为0.6 mol dm-3的表氯醇（epichlorohy

45、drin）溶液处理表面4小时，其中溶剂为1:1混合的浓度为0.4 mol dm-3的氢氧化钠溶液和二甘醇二甲醚（diglyme）。（3）形成水凝胶层。用水充分洗涤金膜表面，再用乙醇充分洗涤除去可溶有机物，再用水充分洗涤。之后将金膜置于右旋糖苷（dextran）溶液中20小时，右旋糖苷溶液配置为3.0 g的T500右旋糖苷溶于10 cm3的浓度为0.1 mol dm-3的氢氧化钠溶液。（4）羧甲基化右旋糖苷。用浓度为1 mol dm-3的溴乙酸（bromoacetic acid）溶液处理表面16小时来完成羧甲基化糖苷，溴乙酸的溶剂是2 mol dm-3的氢氧化钠溶液。循环伏安法测得硫醇化烷烃分子

46、层对金属层的屏蔽作用在这一系列的合成过程中保持得相当完好。经过傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）和多孔聚苯乙烯（XPS）测试，检测到了右旋糖苷的存在，并且大约在一平方毫米的面积内含有13 ng右旋糖苷，且右旋糖苷聚糖的每个葡萄糖单位上大约有一个羧基基团。如此制得的带负电的水凝胶层可以共价固定多种配体。接下来要进行的是“活化-配对-钝化”的过程。从低离子强度的探针分子溶液中提取出带正电的蛋白质探针分子，依靠静电吸引吸附在水凝胶层附近。这些提纯过的蛋白质分子与羧甲基的吸引为二者之间共价结合反应的发生提供了高的反应物浓度。（5）“活化（Activation）”羧基过程。激活水凝胶中的羧基要用浓度为0.

47、2 mol dm-3的N-乙基-N-(3-二甲氨基丙基)二亚胺氢氯化钠的水溶液（EDC）和浓度为0.05 mol dm-3的N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液（NHS）。经过活化后的羧基可以更好的完成“配对”过程。（6）氨基与羧基的“配对（Coupling）”过程。用浓度为60 g cm-3的单克图2.1 固定过程中SPR系统响应隆抗体（monoclonal antibody）溶液与经过激活的金膜表面羧基反应，溶剂为浓度为10 10-3 mol dm-3的乙酸钠，pH值为5.0。利用抗体分子中的亲质子基团（氨基）与水凝胶中的羧基反应共价固定抗体。（7）“钝化（Deactivation）” 乙酸钠过程。

48、溶液中多余的乙酸钠用pH为8.5的浓度为1 mol dm-3的乙醇胺溶液（用氢氧化钠溶液调整pH值）来钝化。这一步骤也可以除去蛋白质分子（单克隆抗体分子）中的盐分。到此为止就完成了探针分子在金属薄膜表面的固定过程。如果在这一过程中持续关注表面等离子体共振传感器的光学指标的变化，得到图2.1所示的结果。图中纵坐标为共振信号，横坐标为时间。(1)处表示加入EDC/NHS激活羧基，(2)处表示加入单克隆抗体分子探针，(3)处表示加入乙醇胺钝化，(4)处表示钝化过程结束。前后的共振信号发生的变化表明金属薄膜上确实共价固定了一定量的单克隆抗体分子探针。 性能分析蛋白质分子中各个氨基酸之间通

49、过肽键连接，但由于其分子侧链中含有的可解离的酚羟基、氨基、羧基、咪唑基等基团的存在，使其成为两性电解质。既可与酸也可与碱反应。溶液中蛋白质分子的带电情况与溶液的pH值有关，在某一pH值处，蛋白质分子中带正电荷的基团数目与带负电荷的基团数目相等，静电荷为零，这时蛋白质分子在电场中不发生移动，此时的pH值称为这一蛋白质分子的等电点。溶液的pH值低于蛋白质分子的等电点时，蛋白质分子带正电；当溶液的pH值高于蛋白质分子的等电点时，蛋白质分子带负电。只要溶液的pH值低于蛋白质分子的等电点，就可以利用这一固定方法固定蛋白质分子，与带负电的水凝胶分子吸引从而引发反应，针对不同的蛋白质分子，溶液的pH值甚至可

50、以高达4。用14C和35S标记蛋白质，放射性测试结果表明每1 mm2的水凝胶可以吸引50 ng的蛋白质分子。对大多数蛋白质分子，这一质量（50 ng）意味着多层蛋白质分子被吸引到了水凝胶表面，这体现出了水凝胶的分支数量的巨大，以及可以提供的结合位点的丰富。结果表明聚糖分子的厚度可以达到100 nm，这个厚度取图2.2 甘氨酸解离过程决于溶液的pH值和离子强度。由于聚糖分子的亲水性，它可以很好地溶于水中，分子的支链可以在水中伸展，有利于结合蛋白质探针分子。表面等离子共振现象对于共振表面以下1微米范围内的介电常数的变化较为敏感，聚糖层的厚度较好地满足了这个范围的要求。图2.2是按照上述固定方法固定

51、了面密度大约为10 ng mm-2的铁传递蛋白抗体的金属薄膜的响应。其中铁传递蛋白溶液的浓度为100 g cm-3，缓冲液含浓度为1010-3 mol dm-3的HEPES（4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulphonic acid）和浓度为0.15 mol dm-3的氯化钠，pH值为7.4。将这样的待测液加入反应池，可以观察到铁传递蛋白与固定上去的铁传递蛋白抗体发生了结合。之后加入了pH值为2.5的甘氨酸（glycine），解离抗体（铁传递蛋白抗体）与抗原（铁传递蛋白）间的结合，这样敏感膜可以用于下一次的检测。合适地选择敏感膜再生条件，可以实现敏感

52、膜的重复利用达50次之多，而响应能维持得很好。图中（1）代表铁传递蛋白溶液的加入；（2）代表铁传递蛋白与抗体的结合达到了动态平衡；（3）代表加入甘氨酸解离；（4）代表解离的结束。2.2.2 金属离子媒介法固定抗体探针分子到金属薄膜上时，不能选择抗体与抗原结合的位点固定蛋白质分子，否则即使抗体得以固定，也无法与抗原结合。可以选择抗体中的聚丙三醇基团51或选择其中的二硫键52，这些部位都与抗体决定簇在空间上距离较远。Dietmar Kroger等人53提出了一种利用六聚组氨酸支链定向地、可逆地固定蛋白质的方法。这一方法的原理是受固定金属亲合色谱法IMAC（immobilized metal aff

53、inity chromatography）的启发，IMAC是用于纯化细菌质粒表达出的重组体蛋白（recombinant proteins）的一项技术。多齿状突起的螯合剂分子被吸附在树脂基质上，与金属离子（通常为镍、铜、锌离子）结合，形成螯合剂分子+金属离子的化合物。螯合剂分子占用了金属离子六个结合位点中的三到四个。其余的结合位点可以被其他电子供体基团如组氨酸占用。通过分子生物学手段，将六聚组氨酸支链合成在蛋白质的特定位点上，这些位点与配体结合点相距较远，从而使蛋白质可以获得与配体的最佳结合效果。由于这些经过改造添加了组氨酸支链的蛋白质分子可以提供电子，与螯合剂分子+金属离子的化合物形成化学键，

54、所以大分子量的蛋白质可以通过这个组氨酸支链被固定在敏感膜上。使用竞争性化合物（如咪唑或组氨酸，它们也是电子供体，可以与螯合剂分子+金属离子的化合物结合）与蛋白质分子竞争性地结合金属离子，就可以实现蛋白质探针分子与敏感膜解离，之后用络合剂乙二胺四乙酸EDTA完全去除金属离子的情况下，可以实现蛋白质固定过程的可逆。用如下的式子来表示这一过程中各个分子间的关系：金(HS-螯合剂分子-NTA)金属离子(组氨酸支链-抗体1)抗原1加入竞争性化合物，如咪唑：金(HS-螯合剂分子-NTA)金属离子咪唑加入乙二胺四乙酸EDTA：金(HS-螯合剂分子-NTA)循环利用（更换了固定的抗体，以检测不同的抗原）：金(

55、HS-螯合剂分子-NTA)金属离子(组氨酸支链-抗体2)抗原2金与螯合剂分子的巯基端之间依靠金硫键自组装结合；螯合剂分子的含有NTA基团的一端与金属离子三价或四价结合；金属离子作为中介在另一侧与抗体的组氨酸支链二价或者三价结合；抗体与抗原特异性结合。Keller等人54描述了利用IMAC技术固定蛋白质的途径，目前进行的研究中，用到了两种螯合剂分子CTA-I、CTA-II（图2.3）。第二种螯合剂分子是一端含有硫代烷烃链、另一端含有螯合基团的化合物。含有硫的一端可以自组装在金膜表面；含有螯合基团的一端是腈化二乙酸NTA（nitrilotriacetic acid）。第一种螯合剂分子含有位于NTA

56、和硫代烷烃链之间的，亲水性的三聚氨基乙酸（甘氨酸Gly）基团。CTA分子通过修饰如图2.4所示长链的HTA分子（hydroxythioalkane）自组装在金膜表面，HTA分子作为惰性的分子层间接控制了CTA分子在金膜表面的集中，并为螯合剂分子的取向提供了合适的方向，同时提供了一个带负电荷的表面。这为控制敏感膜的结合位点数量提供了方便。图2.3 CTA-I与CTA-II的分子结构图2.4 HTA分子结构用分子生物学手段在细菌质粒内植入相应基因，表达出抗溶解酵素蛋白的Fab片段（见第五章中关于抗体结构的描述）D1.3具有六聚组氨酸（-(His)6-）结构。由于这个蛋白质分子的结构已被深入研究过，

57、所以选择它作为样板。将抗溶解酵素蛋白固定到经CTA修饰过的金膜的过程可以使用两种技术手段进行研究：使用表面等离子体共振现象来确定固定上去的蛋白质分子数量；使用傅立叶变换红外光谱计（FTIR）探测固定到金膜上的蛋白质分子的二级结构是否发生了改变。表面等离子体共振现象可以监视敏感膜的形成过程，并且对每个平方单位内吸附的分子数量进行定量检测。因此可以首先观察Fab片段固定到金膜表面的过程，然后再研究Fab片段与溶解酵素之间抗体-抗原的相互作用。FTIR被广泛用于研究蛋白质分子的构造和构象的变化。在这个实验中我们可以使用这一技术来对比溶液中的Fab片段和固定到金膜上的Fab片段的构象（具体的说是蛋白质分子的二级结构）是否发生了改变，从而可以知道固定过程是否造成了蛋白质分子失活。2.2.2.