1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质

1、第 9卷第 4期 2002年 12月中国水产科学Journal of Fishery Sciences of ChinaVol. 9No. 4Dec. , 20021 种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质陈吉祥 ,刘 霜 ,李 筠 ,王祥红 ,杜宗军 ,于德华 ,纪伟尚 ,(青岛海洋大学海洋生命学院 , 达尔文实验室 , 山东 青岛 266003摘要 :从山东省莱州海区自然发病的花鲈(L ateolobrax japanicus 体内分离到 1株致病性鳗弧菌, 经硫酸铵盐析、DEAE 2Sepharose Fast Flow和 Sephadex 2G 100凝胶层析等方法从其培养液中分离纯

2、化了 1 种胞外蛋白酶 。 用 SDS 2PA GE 电泳测得蛋白质的分子量为 3617kD , 酶的最适温度为 50 , 对热不稳定 ,70 15min 完全失去活力 ; 最适 p H为 710;1mmol/L 的 PMSF 对酶活性无影响 , 部分金属离子如 Cu 2+、 Fe 2+、 Fe3+、 Zn 2+对酶活力有抑制作用 , 而 Ca 2+对酶有一定程度的激活作用 ,1mmol/L EDTA 能完全抑制酶的活性 , 表明该酶是 1 种金属蛋白酶 。关键词 :鳗弧菌 ; 胞外蛋白酶 ; 分离纯化 ; 理化性质中图分类号 :S941142文献标识码 :A-8737-05收稿日期 :200

3、1-11-221基金项目 :国家自然科学基金资助项目(39870581 ; 英国达尔文项目(162/8/065 1作者简介 :陈吉祥 (1963- 男 , 副研究员 , 博士后 , 从事海洋微生物学与免疫学 1子 , 已从霍乱弧菌 、 创伤弧菌 -34 从 11 种胞外蛋白 酶 , 证明其对虹鳟 ;Lamas 5利 用鳗弧菌及其胞外蛋白产物对虹鳟进行腹腔注射 后为相似的症状 。肖慧等 6 从山东 沿海养鱼场发病鱼的体内分离到, 虹鳟表现出极 1 株致病性鳗弧菌 , 感 染 实 验 表 明 该 菌 株 对 花 鲈 (L ateolabraxjapanicus 等海水养殖鱼类有较强的致病性, 常伴

4、有严重的血管出血及组织损伤 、 出血等病症 。本研究 从其胞外产物中分离纯化了 1 种胞外蛋白酶 , 并进 行酶的理化性质研究 , 以探讨该菌胞外产物对鱼类 组织损伤及致病作用的机制 。 1 材料和方法 111 实验菌株致病性菌株 W -1 分离自山东省莱州湾海区发病的花鲈 (L ateolabrax japanicus ,经细菌形态学 、Biolog 系统鉴定为鳗弧菌(V ibrio an 2guillarum 。112 试剂及仪器DEAE 2Sepharose Fast Flow、 Sephadex 2G100购自 Pharmacia公司 ,SDS 、 丙烯酰胺 、 牛血清蛋白 、 N ,

5、 N 亚2甲基双丙烯酰胺 、 考马斯亮蓝 R -250、 PMSF等购自上海生物工程公司, 其余试剂为国产分析纯沪西仪器厂 ,UV -730 紫外 分光光度计购自日本岛津公司购自北京六一仪器厂。 113实验方法。 蛋白层析系统购自上海,D YY - 垂直板电 泳仪11311细菌培养及胞外产物获得细菌的培养用 2216E 海水液体培养基,培养温度 28 , 培养时间 24h , 振荡频率为 180r/min 。培养物于 4 5000r/min 离心 10min , 收集上清液 , 再分别用 0145m和 0120m滤膜过滤 , 滤液 -20 保存备用 。 11312酶的分离纯化(1 硫酸铵盐析将

6、上述培养过滤液取出置室温融化后 , 缓慢加入 (N H 4 2SO 4 粉末至 80%饱和 度 ,4 过夜 , 于 10000r/min 离心 15min , 收集沉 淀 , 并溶解于 40mL 0. 02mol/L p H 718 的 Tris 2HCl 缓冲液 , 于 4 条件下透析 24h , 其间充分换水并搅 动 。 最终体积 50mL 左右 。(2 DEAE Sepharose Fast Flow层析将透析液直接加入经 0102mol/L p H 7. 8Tris 2HCl 缓冲液 平衡好的 DEAE -Sepharose Fast Flow 柱 (110cm 15cm , 用含 0

7、0. 5mol/L NaCl 的相同缓冲液梯 度洗脱 , 流速 24mL/h , 每管 1mL 收集洗脱液 , 测 定蛋白吸收和酶活力 。(3 Sephadex G 2100柱层析将收集的上述酶 溶液充分透析 , 并用 PEG 浓缩至体积为 6mL 左 右 , 然后加入到用 0102mol/L p H 7. 8Tris 2HCl 平 衡的 SephadexG 2100 柱 (1cm 100cm 。用相同 缓冲液洗脱 , 流速 15mL/h , 每管 1mL 收集洗脱液 , 测定蛋白吸收和酶活力 。 收集酶活力集中部分 , 冷冻干燥 。11313 酶活力测定 参照 Inamura 方法 4, 以

8、偶氮 酪蛋白为底物 。 具体方法为 015mL 偶氮酪蛋白溶 液 (5mg/mL , p H 8. 0Tris 2HCl 缓冲液配制 , 加入 011mL 酶溶液 , 再加入 014mL 双蒸水 , 混匀后于 25 保温 20min 。加入 5%的三氯乙酸溶液 315 mL , 于室温 3000r/min 离心 5min , 收集上清加入 015mol/L NaOH 溶液 4. 5mL , 于 440nmOD 值 。 在该条件下 OD 值每增加 11 个酶活力单位 (U 。11314Brad 2 ford 方法进行 7, 。11315 SDS 2PAGE 蛋白酶的分子量测 定采用 SDS 2P

9、A GE 垂直板电泳法 : 浓缩胶浓度 3%, 分离胶浓度 10%, 考马斯亮蓝 R 2250 染色 , 中分子 量标准蛋白包括磷酸化酶 B 、 牛血清蛋白 、 卵清蛋 白 、 羧肽酶 、 蛋清溶菌酶 。11316温度对酶活性的影响按 11313 方法在不 同温度下测定酶活力, 确定酶的最适温度 , 另外将蛋 白酶溶液于不同温度保温 , 每隔 15min 取样并迅速 冷却到室温 , 再测定酶的活力 , 确定温度对酶活力影 响 。11317pH 对酶活力的影响分别以不同 p H 的缓 冲液配制底物并稀释酶液 , 再按 11313 方法测定酶 活力 , 确定酶的最适 p H 。11318酶抑制剂及

10、金属离子对酶活力影响将各 种酶抑制剂及金属离子分别加入到酶溶液中 , 于 25 保持 10min , 再用常规方法测定酶活力 , 并计算 酶的活力剩余 。2 结果211 鳗弧菌蛋白酶的分离纯化鳗 弧 菌 蛋 白 酶 粗 酶 液 经 硫 酸 铵 盐 析 后 , 在 DEAE 2Sepharose柱层析中 , 2 峰 , 在 Sephadex G1002峰 , 1,性为 15U/, 4142, 酶的收率为根据该酶在 SDS -PA GE 电泳中的迁移率, 通 过作图法求得酶的分子量3617kD (图 1 。213 温度对酶活力的影响该酶的最适反应温度为50 (图 2 , 是一热不 稳定酶 , 温度

11、较高时 , 随时间延长 , 活力部分丧失 , 超 过 70 时 15min 酶活力即完全丧失(图 3 。 214pH 对酶活力的影响该酶的最适 p H 为 710,p H 4 时蛋白酶活力很 低 , 而在 p H 610 时蛋白酶较稳定 (图 4。表 1鳗弧菌胞外蛋白酶的纯化T able 1Purif ication of protease of Vibrio anguillarum W -1纯化步骤 Purification process 体积 /mLVolume总活力 /UTotal activity比活力 /(U ?mg -1Specific activity得率 /%Y ield r

12、ate纯化倍数 Relative purification培养过滤液Culture filter900100119310671141041001001100硫酸铵沉淀Ammonium sulfate5010011261069166104621641135DEAE 2sepharose fast flow柱层析DEAE 2sepharose fast flow610071921052120105411073108Sephadex G 2100层析 Sephadex G 2100 2810041971052196105251234142 913第 4 期陈吉祥等 :1 种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分

13、离纯化及性质图 1SDS 2PAGE 电泳测定鳗弧菌胞外蛋白酶的分子量Fig. 1Molecular w eight analysis of protease fromV. anguillarum by SDS 2PAGE.A 1 标准分子量蛋白:磷酸化酶 b (97400 , 牛血清白蛋白 (66200 ,卵清蛋白 (42700 , 碳酸酐酶 (31000 , 溶菌酶 (14400 ;B 1 鳗弧菌 蛋白酶A. Standard molecular weight proteins :Phosphorylase b (97400 , Bovine serum ablumin (66200 ,

14、Ovalbumin b (42700 , Carbonic an 2hydrase(31000 , Lysozyme (14400 ; B. Protease from .angillarum.图 2鳗弧菌胞外蛋白酶的最适反应温度Fig. 2Optimum temperature of protease from V. anguil 2larum215 酶抑制剂和金属离子对酶活力的影响如表2所示,SDS可部分抑制酶的活力,2mol/L 的 Urea 对酶活力影响不大, 而增加到 8mol/L 时酶活力部分丧失 ;1mmol/L 的 PMSF 对酶活力 无影响 , 1mmol/L 的 ED TA

15、 完全抑制酶的活性。 部分 金 属 离 子 对 该 酶 有 一 定 的 抑 制 作 用 , 其 中 Cu 2+、 Fe 2+、 Fe 3+、 Zn 2+抑制作用较为明显, 而 Ca 2+对酶有一定程度的激活作用 (表 3。图 3温度对鳗弧菌胞外蛋白酶稳定性的影响Fig. 3E ffects of temperature on stability of protease fromV. anguillarum图 4鳗弧菌胞外蛋白酶的最适pHFig. 4Optimum pH of protease from V. anguillarum W -1表 2抑制剂对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响T able 2E

16、 ffects of inhibitors on V. anguillarum W 21pro 2tease抑制剂Inhibitor浓度 /(mmol ?L -1Concentration酶活力 /(U ?mL -1Enzyme activity相对活力 /%Relative activity 影响Effect对照Control 9200100100EDTA 0110595064167-110000100-SDS 011735079189-1100265028180-Urea 200092001001008000695075154-PMSF011095001001001009500100003

17、 讨论胞外蛋白酶被认为是许多细菌病原的毒力因 子 , 但不同的细菌所产生的胞外蛋白酶不同 , 即使同 一菌种的不同菌株其胞外蛋白酶也有一定的差异 ,23中国水产科学第 9 卷Miyoshi 等 8 从创伤弧菌 (V ibrio v ul nif icus 分离得 到一种金属 蛋 白 酶 , 其分 子 量 为 45kD ; Arnesen 等 9 发现杀鲑气单胞菌 (Aeromonas sal monici dia 的个别菌株胞外产物含有高分子量 (89100kD 和 低分子量 (37kD 的 2 类蛋白酶 , 而大部分菌株只有 高分子量蛋白酶 , 提纯后的低分子量蛋白酶是一种 金属蛋白酶 ,

18、能被 ED TA 和过量的 Zn 2+所抑制 。 Inamura 等 4 从一株致病性鳗弧菌胞外产物中分离 到的蛋白酶分子量为 36kD , 该酶的最适 p H 为 7 8, 最 适 温 度 50 , 能 被 ED TA 所 抑 制 。 Farrell 等 10 通 过 硫 酸 铵 盐 析 、 DEAE 2Sepharose层 析 、 Sepharcryl S 2200层析及 DEAE 高效液相层析从鳗 弧菌 514 分离纯化到分子量为 38kD 和 40kD 的 2 种蛋白酶 , 前者在 p H 中性偏碱的条件下保持最大 活力 , 对丝氨酸 、 酪氨酸或酸性蛋白酶抑制剂不敏 感 , 而被 E

19、D TA 所抑制 , 属于金属蛋白酶 。表 3金属离子对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响T able 3E ffects of metal ions on V. anguillarum W 212 tease抑制剂 Inhibitor浓度 /(mmol ?L -1酶活力 /(-Effect对照Control9200100100CaCl 201109550103126+ 110010600115100+ ZnSO 40110275029185-11001501163-MgSO 40110790085187-1100755082106-FeSO 40110725078180-1100360039130-Fe

20、Cl 30110500154-1100160017139-CuSO 40110400143-110000-本实验从鳗弧菌 W -1 培养液分离到的胞外蛋 白酶分子量为 3617kD , 是一热不稳定性蛋白酶 , 丝 氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF 对该酶无抑制作用 ,110 mmol/L 的 ED TA 能使酶活力完全丧失 , 说明该酶 不属于丝氨酸蛋白酶类 , 而是一种金属蛋白酶 ; 金属 离子 Cu 2+、 Fe 2+、 Fe 3+、 Zn 2+、 Mg 2+等都对该酶具 有抑制作用 , 而 Ca 2+对酶有一定的激活作用 , 可能 与活性部位金属离子的取代或位阻作用有关 ; 在酸 性环境酶活

21、力迅速丧失 , 在 p H 610 保持较高的酶 活性 , 在碱性条件下酶活力较稳定 , 该金属蛋白酶与 Farrell 10 分离的低分子量组分相似 。各种胞外蛋白酶通过不同方式对宿主发生作 用 , 如霍乱弧菌金属蛋白酶可破坏宿主细胞受体 , 切 断和激活霍乱毒素 A 亚单位 , 并能降解肠粘膜以利 于霍乱毒素的作用 ; 创伤弧菌金属蛋白酶能通过降 解基质膜 型胶原蛋白引起溶血反应 ; 嗜水气单胞 菌胞外蛋白酶能引起鲫鱼的败血症症状 11, 有关鳗 弧菌 W -1 胞外蛋白酶的作用 , 我们将另文报道 。参考文献 :1 Booth B A , Finkelstein M B , Finkel

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27、000,23(2 :80-841123 第 4 期陈吉祥等 :1 种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质Purif ication of an extracellular protease fromVibrio anguillarum and its physicochemical propertiesCHEN Ji 2xiang , L IU Shuang , L I Yun , WAN G Xiang 2hong ,DU Z ong 2jun , YU De 2hua , J I Wei 2shang ,(Darwin Laboratory , College of Marine Lif

28、e Sciences , Ocean University of Qingdao , Qingdao 266003, ChinaAbstract :A strain of V ibrio anguillarum W -1was isolated from the diseased seaperch (L ateolabrax japoni 2 cus in Laizhou Bay , Shandong Province , and an extracellular protease was partially purified from the culture so 2 lution of t

29、he V . anguillarum by ammonium sulfate , DEAE 2epharose fast flow and Sephadex G -100. The re 2 sults show that , the molecular weight of the purified enzyme from V . anguillarum by SDS -PA GE is 36. 7 kD ; the optimum temperature for the enzyme activity is 50 ,and the enzyme is heatlabile that it would entire 2 ly lose its activity in 15min at 70 ; the optimum p H is 7. 0;1mmol/L of ED