组织制片技术概述

1、 组织制片技术的概述组织制片技术的概述 组织制片技术的方法组织制片技术的方法 组织制片技术的基本程序组织制片技术的基本程序 苏木精苏木精伊红染色伊红染色 组织制片技术的发展史组织制片技术的发展史 从从16世纪世纪60年代年代hook发明显微镜，开始观察发明显微镜，开始观察和描述软木塞中的细胞至今，组织制片技术随着生和描述软木塞中的细胞至今，组织制片技术随着生命科学的发展而不断进步。命科学的发展而不断进步。 组织制片技术的发展史组织制片技术的发展史 在在19世纪中期，随着生物、物理和化学等学科世纪中期，随着生物、物理和化学等学科的飞速发展，以及显微镜和切片机的逐步完善，组的飞速发展，以及显微镜和

2、切片机的逐步完善，组织学也建立起一整套完整科学的组织制片技术。织学也建立起一整套完整科学的组织制片技术。 组织制片技术的发展史组织制片技术的发展史 特别是特别是20世纪世纪50年代以来，由于组织化学、年代以来，由于组织化学、免疫组织化学等新技术和新仪器的出现，使组织制免疫组织化学等新技术和新仪器的出现，使组织制片技术的应用领域进入了一个崭新的时期。片技术的应用领域进入了一个崭新的时期。 组织制片技术的方法组织制片技术的方法 非组织切片法非组织切片法 组织切片法组织切片法 非组织切片法非组织切片法 组织不经过切片制成观察标本的方法。组织不经过切片制成观察标本的方法。非组织切片法的种类非组织切片法

3、的种类 涂片、压片、铺片、磨片、消化分离标本、涂片、压片、铺片、磨片、消化分离标本、活体标本、整装标本、血管注射标本。活体标本、整装标本、血管注射标本。磨片：对于骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，磨片：对于骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上。然后再进行染色封固在载玻片上。消化分离标本：先将组织分离成小块，然后利用消化分离标本：先将组织分离成小块，然后利用相应的化学物质将细胞间质消化溶解，再用机械相应的化学物质将细胞间质消化溶解，再用机械分离的方法，如水的震荡冲击力，使小块组织分分离的

4、方法，如水的震荡冲击力，使小块组织分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上进行封固。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动上进行封固。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。神经细胞等。 活体标本活体标本 将所采的观察标本加生理盐水后直接将所采的观察标本加生理盐水后直接滴于载玻片上在显微镜下观察。滴于载玻片上在显微镜下观察。整装标本整装标本 将胚胎或小动物经前期固定后整体将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中封藏于盛满固定剂的透明容器中 。将发育至某一将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水、透明阶段的鸡胚整体取出，经固定

5、、染色、脱水、透明后封固于载玻片上的标本。后封固于载玻片上的标本。血管注射标本血管注射标本 将有色物质注射进血管，用酸将有色物质注射进血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本。管标本。 将有色物质注射进血管后，经一系列制将有色物质注射进血管后，经一系列制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。本。组织切片法组织切片法 利用化学试剂将组织经过一系列的固定、脱利用化学试剂将组织经过一系列的固定、脱水、透明后，再利用石蜡、火棉胶或者明胶等支水、透明后，再利用石蜡、火棉胶或者明胶等支持物

6、渗透进组织内部，使组织保持一定的硬度，持物渗透进组织内部，使组织保持一定的硬度，并包埋成块，然后依靠切片机将包埋好的组织块并包埋成块，然后依靠切片机将包埋好的组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。得到的供显微镜下观察的标本的方法。 冰冻切片冰冻切片 将所取材的新鲜组织，经将所取材的新鲜组织，经快速冷冻后再切片，以保快速冷冻后再切片，以保持组织内所含的脂类或某持组织内所含的脂类或某些酶类的活性。些酶类的活性。 为观察急待结果的组织，为观察急待结果的组织，如临床手术所取组织，也如临床手术所取组织，也可用这种方法。

7、可用这种方法。 组织切片标本制作的基本程序组织切片标本制作的基本程序: 1. 取材取材 2. 固定和固定后处理固定和固定后处理 3. 脱水脱水 4. 透明透明 5. 浸蜡与浸蜡与包埋包埋 6. 切片切片 7. 染色染色 8. 封固封固 取取 材材一、动物的处死一、动物的处死 手法迅速、快捷。手法迅速、快捷。 常用方法：常用方法： 1. 麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（乌拉坦或者麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（乌拉坦或者戊巴比妥）。戊巴比妥）。 2. 空气栓塞法空气栓塞法：耳静脉，：耳静脉，2030ml空气空气 3. 击头法：重物猛击，迅速致死。击头法：重物猛击，迅速致死。 4. 颈椎脱

8、臼法：颈椎脱臼法：小白鼠小白鼠 5. 破坏脑和脊髓：金属探针，蛙破坏脑和脊髓：金属探针，蛙 6. 股动脉放血：麻醉后放血使大动物迅速死亡。股动脉放血：麻醉后放血使大动物迅速死亡。二、取材的步骤二、取材的步骤 1. 选择动物选择动物2. 选择取材部位选择取材部位3. 选择切面方向选择切面方向 应根据实验工作的目的和经济能力选择实验动物应根据实验工作的目的和经济能力选择实验动物 肝脏肝脏猪肝猪肝 卵巢卵巢猫猫 胃胃狗狗 运动终板运动终板爬虫类动物爬虫类动物 肥大细胞肥大细胞大、小白鼠的皮下组织大、小白鼠的皮下组织 间皮和内皮间皮和内皮蛙的肠系膜蛙的肠系膜 根据器官组织的结构特点选择取材部位根据器官

9、组织的结构特点选择取材部位 胰腺胰腺胰尾部胰尾部 脊髓的运动神经元脊髓的运动神经元颈膨大和腰膨大处颈膨大和腰膨大处 肺肺 肺门肺门 胃胃胃底部胃底部 根据器官组织的结构特点选择取材时切面的方向根据器官组织的结构特点选择取材时切面的方向 肾脏肾脏肾门处作纵切肾门处作纵切 头皮头皮顺毛根的方向纵切顺毛根的方向纵切 大小肠的环行皱襞大小肠的环行皱襞纵切纵切气管和食管气管和食管横切横切三、取材时应注意的问题三、取材时应注意的问题 ： 组织新鲜：取材动作快捷，迅速投入固定液组织新鲜：取材动作快捷，迅速投入固定液 注意环境温度的影响：冰上取材或者冷固定注意环境温度的影响：冰上取材或者冷固定 材料应小而薄：

10、材料应小而薄： 不超过不超过1.51.5 0.5cm3 固定液会造成组织收缩，注意保持组织原有形态固定液会造成组织收缩，注意保持组织原有形态 取材手术器械锋利规范操作，防止组织损害取材手术器械锋利规范操作，防止组织损害 注意取材环境和器械干净，防止组织污染注意取材环境和器械干净，防止组织污染固定和固定后处理固定和固定后处理一、固定的目的一、固定的目的 ： 固定剂使细胞的成分凝固，防止组织细胞固定剂使细胞的成分凝固，防止组织细胞自溶和腐败，保持细胞生活时的状态。自溶和腐败，保持细胞生活时的状态。 固定剂的酶染作用使细胞各成分易于被染固定剂的酶染作用使细胞各成分易于被染料着色。料着色。 使组织适度

11、硬化，利于制作薄片。使组织适度硬化，利于制作薄片。二、固定的方法：二、固定的方法： 1. 直接固定：最常用。直接固定：最常用。 2. 蒸汽固定：蒸汽固定：12锇酸或者甲醛挥发的蒸锇酸或者甲醛挥发的蒸汽，多用于涂片固定。汽，多用于涂片固定。 3.灌注固定：（必须进行后固定灌注固定：（必须进行后固定） 局部灌注固定：肺、肾脏、眼球、肝脏局部灌注固定：肺、肾脏、眼球、肝脏 全身灌注固定：神经系统全身灌注固定：神经系统三、固定的注意事项：三、固定的注意事项：1. 固定剂的用量固定剂的用量 一般为组织块体积的一般为组织块体积的15倍左右倍左右 2. 固定剂的配制固定剂的配制 现配现用现配现用3. 固定的

12、时间固定的时间 受较多因素的影响。一般过夜或者受较多因素的影响。一般过夜或者24小时小时可达到固定要求。可达到固定要求。 四、常用固定剂四、常用固定剂单纯固定剂单纯固定剂 甲醛甲醛、乙醇乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、冰乙酸、升汞、苦味酸、 重铬重铬酸钾、丙酮、酸钾、丙酮、 铬酸、四氧化锇铬酸、四氧化锇 固定组织时，只单用某一种试剂尚难对各种组固定组织时，只单用某一种试剂尚难对各种组织成分有较理想的固定作用。因此，常加入其它试织成分有较理想的固定作用。因此，常加入其它试剂，根据对组织的作用与反应，配成混合固定剂，剂，根据对组织的作用与反应，配成混合固定剂，以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。以求得补

13、偿某试剂对组织所致的缺陷。混合固定剂混合固定剂 中性甲醛液中性甲醛液、乙醇乙醇甲醛液甲醛液、 bouin氏液氏液、 苦味酸苦味酸硫酸液硫酸液 、carnoy氏液氏液 、helly氏液氏液甲醛甲醛(formeldedhyde)固定浓度：固定浓度： 4%甲醛溶液甲醛溶液固定时间：固定时间： 12小时小时24小时小时固定后处理：固定后处理： 流水冲洗流水冲洗12小时小时24小时小时配制方法：配制方法： 甲醛甲醛10ml + 生理盐水生理盐水/蒸溜水蒸溜水90ml特性：特性： 甲醛放置时间过长易产生白色沉淀甲醛放置时间过长易产生白色沉淀“三聚三聚甲醛甲醛”，氧化后变为甲酸，使溶液变为酸性，严重，氧化后

14、变为甲酸，使溶液变为酸性，严重时可影响到细胞核着色（时可影响到细胞核着色（）。）。乙醇乙醇(ethyl alcohol) 固定浓度：固定浓度： 80%-90%乙醇液乙醇液 固定时间：固定时间： 一般一般4小时小时12小时小时 固定后处理：固定后处理： 直接入脱水剂直接入脱水剂 配制方法：配制方法： 无水乙醇无水乙醇 + 蒸馏水蒸馏水 特性：特性： 乙醇具有固定、脱水等多种功能。组织在高乙醇具有固定、脱水等多种功能。组织在高浓度乙醇中放置时间过长时，易发脆。浓度乙醇中放置时间过长时，易发脆。50%以上浓度的乙醇可溶解组织内脂肪、类脂体、以上浓度的乙醇可溶解组织内脂肪、类脂体、色素等，注意制片的目

15、的色素等，注意制片的目的（） 。中性甲醛液中性甲醛液 配制方法：配制方法： 40%甲醛甲醛 120ml 蒸馏水蒸馏水 880ml 磷酸二氢钠磷酸二氢钠 4g 磷酸氢二钠磷酸氢二钠 13g固定时间：固定时间： 24小时小时固定后处理：固定后处理： 流水冲洗流水冲洗24小时小时适用组织：适用组织： 常用固定剂，适用广泛常用固定剂，适用广泛（）乙醇乙醇甲醛液（甲醛液（af液）液） 配制方法：配制方法： 95%乙醇乙醇90ml 40%甲醛甲醛10ml 固定时间：组织块固定固定时间：组织块固定412小时，小时， 铺片固定铺片固定 510分钟。分钟。 固定后处理：直接入脱水剂。固定后处理：直接入脱水剂。

16、适用组织：肥大细胞，糖原的固定适用组织：肥大细胞，糖原的固定（） 。 bouin氏液氏液配制方法：饱和苦味酸溶液配制方法：饱和苦味酸溶液75ml 40%甲醛甲醛25ml 冰乙酸冰乙酸5ml固定时间：固定时间：1224h固定后处理：固定后处理：70%乙醇脱去苦味酸产生的黄色乙醇脱去苦味酸产生的黄色适用组织：常备固定液，特别适用于固定皮肤适用组织：常备固定液，特别适用于固定皮肤和胚胎组织。和胚胎组织。五、固定后处理五、固定后处理 除去组织中渗入的固定液和一些由固定液产生的沉淀、除去组织中渗入的固定液和一些由固定液产生的沉淀、结晶和色素的步骤称为固定后处理。结晶和色素的步骤称为固定后处理。主要有以下

17、六种方法：主要有以下六种方法：1. 流水冲洗流水冲洗 ：重铬酸钾、甲醛固定的组织，要经过流水：重铬酸钾、甲醛固定的组织，要经过流水冲洗冲洗24h。2. 酒精脱黄酒精脱黄 : 含有苦味酸的固定液固定的组织，必须经含有苦味酸的固定液固定的组织，必须经过过70乙醇洗涤脱去黄色。乙醇洗涤脱去黄色。 脱脱 水水一、定义一、定义 用某种能与透明剂互溶的化学试剂将组织内用某种能与透明剂互溶的化学试剂将组织内的水分逐渐置换出来的过程。的水分逐渐置换出来的过程。 要点：缓慢、彻底、勿过度。要点：缓慢、彻底、勿过度。二、常用二、常用脱水剂脱水剂 乙醇乙醇、丙酮、正丁醇丙酮、正丁醇 乙醇乙醇固定剂固定剂 + 脱水剂

18、脱水剂上行酒精脱水上行酒精脱水70%（30%）100%，以，以10递增。递增。丙酮丙酮脱水强，但对组织的收缩脆化作用也强；脱水强，但对组织的收缩脆化作用也强；主要用于组织的固定兼脱水或切片的快速脱水，以保护主要用于组织的固定兼脱水或切片的快速脱水，以保护某些特殊染色的标本不被褪色。某些特殊染色的标本不被褪色。 透透 明明一、定义一、定义 对组织的最后脱水处理。对组织的最后脱水处理。 在经过前一阶段的在经过前一阶段的“脱水脱水”后，还要借某种后，还要借某种有机溶媒将酒精完全置换，使组织与所用的包埋有机溶媒将酒精完全置换，使组织与所用的包埋介质相溶而浸渗。介质相溶而浸渗。二、常用透明剂二、常用透明

19、剂 二甲苯二甲苯、苯甲酸甲脂苯甲酸甲脂、三氯甲烷、三氯甲烷 、冬青油、冬青油 二甲苯二甲苯 为无色透明的液体，易挥发，长期接触对呼吸道粘膜为无色透明的液体，易挥发，长期接触对呼吸道粘膜有较强的刺激作用有较强的刺激作用20分钟分钟1个小时，大块组织可适当延长时间。个小时，大块组织可适当延长时间。作用迅速，浸泡时间过长易发生过度收缩和脆化作用迅速，浸泡时间过长易发生过度收缩和脆化苯甲酸甲脂苯甲酸甲脂为无色透明的液体，易挥发为无色透明的液体，易挥发透明作用较二甲苯缓慢，透明时间透明作用较二甲苯缓慢，透明时间12-24小时。小时。对组织块的收缩和脆化的影响较小。对组织块的收缩和脆化的影响较小。苯甲酸甲

20、脂与火棉胶互溶，用于火棉胶切片的透明苯甲酸甲脂与火棉胶互溶，用于火棉胶切片的透明 用石蜡做为支撑剂将组织包埋成块使其硬化的过程用石蜡做为支撑剂将组织包埋成块使其硬化的过程 包括浸蜡和包埋两步包括浸蜡和包埋两步一、浸蜡一、浸蜡 组织透明后，用石蜡置换组织内部的透明剂的组织透明后，用石蜡置换组织内部的透明剂的过程称为过程称为浸蜡浸蜡。 组织块浸蜡一般先经过低熔点蜡，再经过高熔组织块浸蜡一般先经过低熔点蜡，再经过高熔点蜡。点蜡。 包包 埋埋 高溶点蜡也称高溶点蜡也称硬蜡硬蜡溶点在溶点在60-62硬蜡箱的温度控制在硬蜡箱的温度控制在62-64之间之间组织浸蜡时间一般不超过组织浸蜡时间一般不超过1小时小

21、时 低溶点蜡也称低溶点蜡也称软蜡软蜡溶点在溶点在48-50 软蜡箱的温度控制在软蜡箱的温度控制在5254之间之间 组织浸蜡时间一般可达组织浸蜡时间一般可达24小时小时二、包埋二、包埋 组织浸蜡完成后，接着进行组织块包埋。组织浸蜡完成后，接着进行组织块包埋。用于包埋的是硬蜡。包埋在包埋器中完成。用于包埋的是硬蜡。包埋在包埋器中完成。 修整蜡块时，组织块应距蜡块边缘修整蜡块时，组织块应距蜡块边缘23毫毫米，以利于连续切片。米，以利于连续切片。 切切 片片 石蜡切片石蜡切片 组织切片中应用最为广泛的一种切片就是用组织切片中应用最为广泛的一种切片就是用石蜡作为包埋剂制作的切片。易于制作大量菲薄石蜡作为

22、包埋剂制作的切片。易于制作大量菲薄的组织标本，而且包埋块可长期保存。的组织标本，而且包埋块可长期保存。一、仪器及器材一、仪器及器材二、切片过程：二、切片过程： 调节恒温水箱水温至调节恒温水箱水温至47左右；左右； 固定蜡块于固定器；固定蜡块于固定器； 快修装置修整包埋面；快修装置修整包埋面； 调节切片厚度至调节切片厚度至46微米；微米； 连续切片；连续切片； 摊片于水箱内；摊片于水箱内； 将蜡片贴于涂好粘片剂的载玻片上；将蜡片贴于涂好粘片剂的载玻片上； 置于温箱内烤片。置于温箱内烤片。三、切片的注意事项三、切片的注意事项 切片前要将切片机各部位的螺丝旋紧，否则会切片前要将切片机各部位的螺丝旋紧

23、，否则会引起切片机各部件震动，造成切片厚薄不匀。引起切片机各部件震动，造成切片厚薄不匀。 包埋块的切面和切片刀的倾斜度之间的夹角应包埋块的切面和切片刀的倾斜度之间的夹角应按切片机刀台上的刻度作适当调整。按切片机刀台上的刻度作适当调整。 恒温水箱的温度应比包埋蜡的溶点低恒温水箱的温度应比包埋蜡的溶点低5-6。染染 色色 一、一、染料染料 指分子中含有指分子中含有发色团发色团和和助色团助色团的有机化合物，有鲜的有机化合物，有鲜艳的色彩，对于组织有极强的亲和力。艳的色彩，对于组织有极强的亲和力。 根据根据来源来源可分为两类：可分为两类： 天然染料（卡红、苏木精）天然染料（卡红、苏木精） 人工合成染料

24、（苦味酸、桔黄人工合成染料（苦味酸、桔黄g） 根据其根据其化学性质化学性质分为：分为： 碱性染料碱性染料(basic dye) 酸性染料酸性染料(acid dye) 中性中性(neutrophilia)染料染料二、染色的原理二、染色的原理 染色染色就是染料和组织细胞的分子相互结合，使组织和就是染料和组织细胞的分子相互结合，使组织和细胞着色。细胞着色。 化学反应化学反应 在组织细胞内含有酸性物质和碱性物质。染在组织细胞内含有酸性物质和碱性物质。染色时酸性物质与碱性染料结合；碱性物质与酸性染料结合。色时酸性物质与碱性染料结合；碱性物质与酸性染料结合。细胞核中主要由酸性物质组成（如核酸等），所以与苏

25、木细胞核中主要由酸性物质组成（如核酸等），所以与苏木精等碱性染料有很强的亲和力。细胞质主要由碱性物质组精等碱性染料有很强的亲和力。细胞质主要由碱性物质组成，所以与伊红等酸性染料有很强的亲和力。成，所以与伊红等酸性染料有很强的亲和力。 能被碱性染料着色的物质：嗜碱性能被碱性染料着色的物质：嗜碱性(basophilia)； 能被酸性染料着色的物质：嗜酸性能被酸性染料着色的物质：嗜酸性(acidophilia)。三、染色的注意事项：三、染色的注意事项：1.溶媒：水和乙醇。溶媒：水和乙醇。2.浓度：低浓度，长时间。浓度：低浓度，长时间。3. 温度：高，染色效果明显。温度：高，染色效果明显。4. 适当使

26、用媒染剂、促染剂和分化剂。适当使用媒染剂、促染剂和分化剂。媒染剂媒染剂：能增强染料对组织的着色能力，其本身与染料或组织能增强染料对组织的着色能力，其本身与染料或组织发生结合的试剂。如配制各种苏木精染色液时添加的钾明矾、发生结合的试剂。如配制各种苏木精染色液时添加的钾明矾、铵明矾等。铵明矾等。促染剂促染剂：能增强染料对组织的着色能力，本身并不参与染色反能增强染料对组织的着色能力，本身并不参与染色反应。如伊红染色液中添加的冰乙酸等。应。如伊红染色液中添加的冰乙酸等。分化剂分化剂：能除去组织上和切片上过染的染色液，使染色部位与：能除去组织上和切片上过染的染色液，使染色部位与周围组织对比鲜明，着色深浅适当；例如低浓度的盐酸、醋酸周围组织对比鲜明，着色深浅适当；例如低浓度的盐酸、醋酸、高锰酸钾、重铬酸钾等。、高锰酸钾、重铬酸钾等。封封 固固一、定义一