常见化学发光技术3

1、现代免疫分析技术及展望现代免疫分析技术及展望湖北省临床检验中心湖北省临床检验中心黄黄 鹏鹏不适当的评价限及分组方法不适当的评价限及分组方法对能力验证对能力验证/ /室间质评结果所造成的影响室间质评结果所造成的影响（以肿瘤标志物检测为例，适合内分泌检测）（以肿瘤标志物检测为例，适合内分泌检测） 一、湖北省肿瘤标志物能力验证一、湖北省肿瘤标志物能力验证/ /室间质评活动指室间质评活动指定值（靶值）确定进程定值（靶值）确定进程 自自20072007年始，依年始，依北京科临易检软件公司北京科临易检软件公司提供的室间质评软件，提供的室间质评软件，借鉴借鉴部临检中心对肿瘤标志物采用的相关评价方法部临检中心

2、对肿瘤标志物采用的相关评价方法，在指定值（靶，在指定值（靶值）确定上经历了如下进程：值）确定上经历了如下进程： 二、不同类型检测试剂盒、仪器及实验检测方法二、不同类型检测试剂盒、仪器及实验检测方法分组统计结果间的比较分组统计结果间的比较 三、湖北省肿瘤标志物检测三、湖北省肿瘤标志物检测能力验证能力验证/ /室间质评活动指定值（靶值）确定的发展趋势室间质评活动指定值（靶值）确定的发展趋势 对现代免疫分析技术进行系统性回顾尤为必要对现代免疫分析技术进行系统性回顾尤为必要 （一）酶联免疫吸附试验（一）酶联免疫吸附试验（ELISAELISA） 1 1、待检标本（、待检标本（抗体或抗原抗体或抗原）与）与

3、酶标记抗原或抗体酶标记抗原或抗体按一定按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体发生特异免疫反应；程序与结合在固相载体上的抗原或抗体发生特异免疫反应； 2 2、反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合，与、反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合，与待检抗体或抗原量成一定比例；待检抗体或抗原量成一定比例； 3 3、加酶反应底物后，底物可在酶作用下出现、加酶反应底物后，底物可在酶作用下出现颜色反应颜色反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。 ELISAELISA方法方法: : 既特异又敏感。既特异又敏感。 应用此技术的自动化仪器设备

4、包括：应用此技术的自动化仪器设备包括： 罗氏公司罗氏公司: : ES300ES300、 Cobas CoreCobas Core（IIII） Bio-Rad Bio-Rad 公司：公司： CODACODA、EVOLISEVOLIS （三）（三） 酶促放大时间分辨荧光免疫分析酶促放大时间分辨荧光免疫分析（EATRF IAEATRF IA） 引入了时间分辨荧光免疫技术，有利于排除特异荧光的引入了时间分辨荧光免疫技术，有利于排除特异荧光的干扰，并经酶促信号放大，增强了测量的特异性。干扰，并经酶促信号放大，增强了测量的特异性。 见于美国见于美国 M D M D 公司公司（Molecular Devic

5、es CorporationMolecular Devices Corporation）的）的SPECTRA max GEMINI XSSPECTRA max GEMINI XS。 （一）（一） 透射浊度法（透射浊度法（TurbidimetryTurbidimetry） 1 1、抗原抗体复合物，使介质浊度发生改变；、抗原抗体复合物，使介质浊度发生改变； 2 2、光线通过抗原抗体反应后的溶液，被复合物微粒吸、光线通过抗原抗体反应后的溶液，被复合物微粒吸收；收； 3 3、透射光被吸收的量（吸光度）与免疫复合物的量呈、透射光被吸收的量（吸光度）与免疫复合物的量呈正相关；正相关； 4 4、测量透射光强

6、度，与已知浓度的抗原对照，计算被、测量透射光强度，与已知浓度的抗原对照，计算被检测溶液抗原的含量。检测溶液抗原的含量。 优点：优点：合适的试剂，可在生化分析仪中作全自动分析。合适的试剂，可在生化分析仪中作全自动分析。 （二）（二） 散射浊度法散射浊度法（NepHelometryNepHelometry） 1 1、一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原、一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原抗体复合物微粒；抗体复合物微粒； 2 2、光线被微粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发、光线被微粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物大小、多少密切相关；射光的波长和抗原抗

7、体复合物大小、多少密切相关； 3 3、散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测物越、散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测物越多，形成的复合物越多，散射光强度越强；多，形成的复合物越多，散射光强度越强； 4 4、仪器通过微电脑对测量数据自动分析处理，即可得、仪器通过微电脑对测量数据自动分析处理，即可得知待测抗原的含量。知待测抗原的含量。 此原理研发的全自动分析系统有：此原理研发的全自动分析系统有： Beckman-Coulter Beckman-Coulter 公司：公司：ArrayArray和和ImmageImmage SIEMENS SIEMENS的的 BNBN系列产品系列产品 三三 、

8、荧光免疫分析（、荧光免疫分析（FIA） 是抗原是抗原- - 抗体结合反应与荧光物质发光分析相结合的免抗体结合反应与荧光物质发光分析相结合的免疫分析技术。疫分析技术。 以双抗夹心法为例：以双抗夹心法为例： 1 1、首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；、首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 2 2、除去未结合抗体，加受检标本，使其中的蛋白抗原、除去未结合抗体，加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物；与固相抗体形成抗原抗体复合物； 3 3、洗涤除去未结合物，加入荧光标记的抗体，使之与、洗涤除去未结合物，加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体抗原特异性

9、结合，形成抗体- -抗原抗原- -抗体复合物；抗体复合物； 4 4、最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。、最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 普通的荧光检测水平能达到普通的荧光检测水平能达到ng/Lng/L至至mg/Lmg/L。 荧光免疫分析系统（荧光免疫分析系统（FIAFIA系统）的分析技术包括：系统）的分析技术包括： 荧光偏振免疫分析荧光偏振免疫分析（FPIAFPIA）；）； 荧光酶免疫分析荧光酶免疫分析（FEIAFEIA）；）； 时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析（TRFIATRFIA）。）。（二）荧光酶免疫分析（二）荧光酶免疫分析（FEIAFEIA） 1 1、利用酶

10、标记抗原（或抗体）与待检抗原（或抗体）反、利用酶标记抗原（或抗体）与待检抗原（或抗体）反应；应； 2 2、借助、借助酶反应荧光底物酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定、高效的，经酶促反应生成稳定、高效的荧光物质；荧光物质； 3 3、通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量、通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。 代表性仪器为：代表性仪器为： 法国梅里埃公司的法国梅里埃公司的VIDASVIDAS全自动荧光酶免疫分析系统等。全自动荧光酶免疫分析系统等。 五、五、 流式细胞分析流式细胞分析 流式细胞分析是综合流式细胞分析是综合激光技术、计算机技术、显微荧光激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术

11、、流体喷射技术、分子生物学和免疫学多门学光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学多门学科科的科学技术。的科学技术。 流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理 1 1、采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性、采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；与激发效率； 2 2、利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，、利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；保证检测的灵敏度和特异性； 3 3、用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多、用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据分析，保证检测速度与统计分析的精确个参数信号进行数据

12、分析，保证检测速度与统计分析的精确性。性。 代表的分析仪有：代表的分析仪有： 贝克曼的贝克曼的EPICSEPICS流式细胞仪流式细胞仪 BD BD的的 FACSCaliburFACSCalibur流式细胞仪流式细胞仪 六六 、生物芯片、生物芯片 生物芯片（生物芯片（BiochipBiochip）又称微阵列（）又称微阵列（MicroarrayMicroarray），是），是一种通过微加工技术和微电子技术，在固相载体芯片表面构一种通过微加工技术和微电子技术，在固相载体芯片表面构建的微型生物化学分析系统。建的微型生物化学分析系统。 在面积很小（可达几个平方毫米）的固相材料（玻片、在面积很小（可达几个

13、平方毫米）的固相材料（玻片、硅片、金属片、尼龙膜等）芯片表面，有序地点阵固定排列硅片、金属片、尼龙膜等）芯片表面，有序地点阵固定排列一定数量的可寻址分子（一定数量的可寻址分子（DNADNA、抗体或抗原等蛋白质及其他、抗体或抗原等蛋白质及其他分子）。分子）。 这些成分与待测成分及相应的标记分子结合或反应这些成分与待测成分及相应的标记分子结合或反应，结，结果以荧光、化学发光或酶显色等指示，果以荧光、化学发光或酶显色等指示，再用扫描仪或再用扫描仪或CCDCCD摄摄像等技术记录，像等技术记录，经计算机软件处理和分析，最后得到所需要经计算机软件处理和分析，最后得到所需要的信息。的信息。 生物芯片能够在短

14、时间内分析大量的生物分子，快速准确生物芯片能够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍效率是传统检测手段的成百上千倍。 由于生物芯片技术在疾病筛查和早期诊断上的优势，已经由于生物芯片技术在疾病筛查和早期诊断上的优势，已经成为检验医学发展的热点之一。成为检验医学发展的热点之一。 英国朗道公司（英国朗道公司（RANDOXRANDOX）生产的）生产的EVIDENCE180EVIDENCE180全自动生物全自动生物芯片分析仪，在一张芯片分析仪，在一张9mm9mm2 2的正方形固相载体芯片上，可同时进的正方形固相载体芯片上，可同

15、时进行多种肿瘤标志蛋白质或细胞因子检测。行多种肿瘤标志蛋白质或细胞因子检测。ImmunoAssayImmunoAssay）。）。生物芯片分析仪生物芯片分析仪七、七、 展望展望 随着各种免疫技术及其他科学技术的进步，使得临床免疫随着各种免疫技术及其他科学技术的进步，使得临床免疫分析向分析向自动化、规范化、标准化、集成化、微型化、网络化、自动化、规范化、标准化、集成化、微型化、网络化、系统化与一体化系统化与一体化，不断提高实验结果的灵敏度、精密度和速度，不断提高实验结果的灵敏度、精密度和速度，促进实验室之间结果互认的方向发展。促进实验室之间结果互认的方向发展。 随着免疫检验的自动化，检验同仁们应注重随着免疫检验的自