柑橘皮渣中黄酮类化合物的活性研究

1、a1柑橘皮渣中黄酮类化合物的柑橘皮渣中黄酮类化合物的生物活性研究生物活性研究报告人：报告人： 王道庆王道庆 指导老师：指导老师： 郑旭煦郑旭煦 教授教授 殷钟意殷钟意 高级实验师高级实验师 郭莉霞郭莉霞 老师老师 重庆工商大学重庆工商大学 环境与生物工程学院环境与生物工程学院 药物化学与化学生物学研究中心实验室药物化学与化学生物学研究中心实验室 a2研究背景与意义研究背景与意义 柑橘类黄酮是一系列具有显著生物活性的柑橘类黄酮是一系列具有显著生物活性的黄酮类化合物所组成的混合物黄酮类化合物所组成的混合物,它们具有良好它们具有良好的水溶性和显著的药理作用，如橙皮苷有抗的水溶性和显著的药理作用，如橙

2、皮苷有抗炎、抗氧化、保护心血管系统等作用，柚皮炎、抗氧化、保护心血管系统等作用，柚皮苷具有降血脂、抗癌等功效，川陈皮素能够苷具有降血脂、抗癌等功效，川陈皮素能够促进脂质代谢与血糖的代谢。促进脂质代谢与血糖的代谢。 近年来，随着柑橘种植面积不断扩大，我近年来，随着柑橘种植面积不断扩大，我国西南地区已成为亚洲最大的橙汁加工基地。国西南地区已成为亚洲最大的橙汁加工基地。柑橘被榨出汁后，产生的果渣废弃物多采用柑橘被榨出汁后，产生的果渣废弃物多采用填埋方式处理，既造成环境污染，又浪费资填埋方式处理，既造成环境污染，又浪费资源。因此，对柑橘皮渣中黄酮类化合物的生源。因此，对柑橘皮渣中黄酮类化合物的生物活性

3、的研究既可指导对柑橘皮渣的合理利物活性的研究既可指导对柑橘皮渣的合理利用，大大提高经济价值，又可缓解橙汁加工用，大大提高经济价值，又可缓解橙汁加工废弃物造成的环境污染。这对柑橘类黄酮的废弃物造成的环境污染。这对柑橘类黄酮的研究进展与环境保护都具有重大意义。研究进展与环境保护都具有重大意义。 a3创新性创新性 本课题不仅检测了黄酮类化合物中各单体对本课题不仅检测了黄酮类化合物中各单体对NMU2R的激的激活效应，还通过利用活效应，还通过利用NMU2R的的siRNA干扰分析及阴性对照实干扰分析及阴性对照实验，排除了假阳性的干扰。验，排除了假阳性的干扰。 本课题确定了有效成分的效能（药物能产生的最大效

4、本课题确定了有效成分的效能（药物能产生的最大效应）、半效浓度（药物作用效效应达到最大效应一般时所需应）、半效浓度（药物作用效效应达到最大效应一般时所需要的剂量或浓度）与效价强度（药物产生一定效应所需的剂要的剂量或浓度）与效价强度（药物产生一定效应所需的剂量或浓度）量或浓度） 。 a4研究内容研究内容1、柑橘皮提取物对、柑橘皮提取物对NMU2R的激活效应；的激活效应；2、各种黄酮类化合物单体对、各种黄酮类化合物单体对NMU2R的激活效应；的激活效应；3、通过阴性细胞株进行假阳性分析；、通过阴性细胞株进行假阳性分析；4、通过、通过siRNA干扰干扰NMU2R表达进行假阳性分析。表达进行假阳性分析。

5、a5柑橘类黄酮混合物活性检测柑橘类黄酮混合物活性检测各种柑橘类黄酮单体活性检测各种柑橘类黄酮单体活性检测阴性细胞株对照阴性细胞株对照siRNA干扰对照干扰对照方法流程图方法流程图a6本文以荧光素酶响应倍数（药品-Forskolin叠加作用组响应值除以Forskolin对照组响应值）大于2为活性判断基准。对柑橘皮提取物及柑橘皮提取混合物中的主要黄酮类化合物橙皮苷、柚皮苷、橘皮素和川陈皮素进行了NMU2R活性检测，并且与NMU2R的内源配体NMU的活性进行比较，它们的荧光素酶活性值最大值如下图所示。柑橘类黄酮化合物的荧光素酶响分析柑橘类黄酮化合物的荧光素酶响分析a7柑橘类黄酮化合物的荧光素酶响分析

6、柑橘类黄酮化合物的荧光素酶响分析1000ug/ml Extracts500ug/ml Hesperidin500ug/ml Naringin100ug/ml Tangeretin20ug/ml Nobiletin5uM NMU024681012Multiple of responseSamples响应值倍数响应值倍数大于大于2a8为了求出柑橘皮提取物、橙皮苷和川陈皮素可产生的最大效应效能（Efficacy）、半数有效浓度 (EC50)及药物激活效应（响应倍数）为2时的效价强度（Potency），我们对不同浓度的柑橘皮提取物、橙皮苷和川陈皮素的NMU2R活性进行了检测，将药物浓度以10为底的对数

7、（Log10C）及荧光素酶响应倍数(Multiple of response)S曲线拟合，并求出它们的曲线关系式 。效能、半数有效浓度及效价强度分析效能、半数有效浓度及效价强度分析a9不同浓度的橘皮提取物对不同浓度的橘皮提取物对NMU2R的激活效果的激活效果 0.00.51.01.52.02.53.00246810Multiple of responseLog10C)273. 0097. 2exp(136. 8229. 9yxa10不同浓度的橙皮苷对不同浓度的橙皮苷对NMU2R的激活效果的激活效果 0.00.51.01.52.02.53.01.01.52.02.53.03.54.04.5Log

8、10C Multiple of response )183. 0289. 2exp(1586. 3688. 4yxa11不同浓度的川陈皮素对不同浓度的川陈皮素对NMU2R的激活效果的激活效果 -1.0-0.50.00.51.01.50.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0Log10C Multiple of response )303. 0377. 0exp(1002. 4899. 4yxa12药物的效能、半效浓度及效价强度药物的效能、半效浓度及效价强度drugEfficacyEC50（g/ml）Potency（g/ml）Extract of citrus peel9.22

9、9125.14738.957Hesperidin4.688194.536122.564Nobiletin4.8992.3821.214由关系式、由关系式、 求出柑橘皮提取物、橙皮苷和川陈皮求出柑橘皮提取物、橙皮苷和川陈皮素的效能（素的效能（Efficacy）、半数有效浓度）、半数有效浓度 (EC50)及效价强度及效价强度（Potency），见下表。通过表），见下表。通过表1看出，提取物的效能最高，看出，提取物的效能最高，药物橙皮苷和川陈皮素产生的最大效应也都比较大，且两种药物橙皮苷和川陈皮素产生的最大效应也都比较大，且两种药物之间差距不是很大，而两种药物的效价与半效浓度却有药物之间差距不是很大

10、，而两种药物的效价与半效浓度却有一定差距，橙皮苷的浓度明显高于川陈皮素，即川陈皮素效一定差距，橙皮苷的浓度明显高于川陈皮素，即川陈皮素效价强度较大。价强度较大。a13由于在细胞中影响荧光素酶响应信号通路的因素很多，可能出现未通过NMU2R受体通路而是通过其它方式导致报告基因仍然表达的现象，造成假阳性。因此，我们进行了阴性对照实验与siRNA干扰实验，检测了在细胞不能表达或者表达受到限制时，荧光素酶的响应情况。不能表达NMU2R的高通量筛选模型细胞株（阴性细胞株）进行荧光素酶响应实验。实验显示，与NMU对照组和空白对照组相比较，在单独给药和与Forskolin叠加给药时，橙皮苷和川陈皮素组的荧光

11、素酶响应值都没有明显差别，见图7。这说明在细胞没有表达NMU2R时，橙皮苷和川陈皮素不能引起荧光素酶的响应。阴性细胞株荧光响应分析阴性细胞株荧光响应分析a14阴性细胞株荧光响应分析阴性细胞株荧光响应分析HesperidinNobiletinNMUControl groups020004000600080001000012000140001600018000Response of luciferaseSamples Drug groups Drug+Forskolin groups通过不能表达NMU2R的高通量筛选模型细胞株（阴性细胞株）进行荧光素酶响应实验。我们发现，与NMU对照组和空白对照组

12、相比较，在单独给药和与Forskolin叠加给药时，橙皮苷和川陈皮素组的荧光素酶响应值都没有明显差别。这说明在细胞没有表达NMU2R时，橙皮苷和川陈皮素不能引起荧光素酶的响应。a15siRNA干扰分析干扰分析NMU2R-1NMU2R-2C020406080100Expression of NMU2R(% of control)提取用提取用siRNA干扰干扰24 h的的NMU2R细胞的蛋白，利用细胞的蛋白，利用Western blot实验分析干扰效率。实验分析干扰效率。a16由上图可知，由上图可知，NMU2R-1序列（序列（487，GCGCAACTAC CCTTTCTTGTT）的干扰效率为）的干

13、扰效率为47.6%，NMU2R-2序序列（列（790，GCCCATGTGGATCTACAATTT）的干扰）的干扰效率为效率为42.9%；两个序列都能干扰；两个序列都能干扰NMU2R细胞中细胞中NMU2R的表达，但的表达，但NMU2R-1序列的干扰效果优于序列的干扰效果优于NMU2R-2序列。因此，以序列。因此，以NMU2R细胞株作对照，收细胞株作对照，收集用集用NMU2R-1序列的序列的siRNA干扰了干扰了24 h的的NMU2R细细胞，接入胞，接入96孔板，分别用孔板，分别用500g/ml橙皮苷、橙皮苷、5g/ml川川陈皮素和陈皮素和5M NMU进行进行NMU2R细胞株荧光素酶检测细胞株荧光

14、素酶检测实验，结果如下。实验，结果如下。a17siRNA干扰对样品荧光素酶活性的影响干扰对样品荧光素酶活性的影响 500ug/ml Hesperidin5ug/ml Nobiletin5uM NMU0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Multiple of responseSamples NMU2R-1 C由图中由图中NMU对照组可对照组可知，通过知，通过siRNA干扰，干扰，干扰组的干扰组的NMU2R表达表达明显下降。给细胞加药明显下降。给细胞加药后，相对于未干扰组，后，相对于未干扰组，干扰组的荧光素酶的响干扰组的荧光素酶的响应倍数明显下降。说明应倍数明显下降。说明荧光素酶给药响应与荧光素酶给药响应与NMU2R表达相关。表达相关。 a18结论结论1、柑橘皮提取物（即柑橘类黄酮混合物）能有效激活、柑橘皮提取物（即柑橘类黄酮混合物）能有效激活 NMU2R,说明混合物中有能激活说明混合物中有能激活NMU2R的物质。的物质。2、混合物中的两种单质、混合物中的两种单质橙皮苷和川陈皮素能单独激活橙皮苷和川陈皮素能单独激活NMU2R。3、橙皮苷和川陈皮素的、橙皮苷和川陈皮素