8吸光光度法54学时2011

1、第九章第九章吸吸 光光 光光 度度 法法absorption photometry化学分析化学分析：常量组分：常量组分(1%), er 0.1%0.2% 依据化学反应依据化学反应, 使用玻璃仪器使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较仪器分析仪器分析：微量组分：微量组分(105为高灵敏度为高灵敏度; 104为低灵敏度为低灵敏度.解：解： c (fe) = 1.0 mg/l =1.010-3/55.85 mol/l = 1.810-5 mol/l1145101110812380 cmmoll.1%1cme例例1 邻二氮菲光度法测铁邻二氮菲光度法测铁 (fe) = 1.0

2、 mg/l, b=2.0 cm , a = 0.38 计算计算 和和cbea%cm 11c = 1.0 mg/l = 1.0103 g/1000 ml = 1.0104 g/100ml1%m431c-=0.38/2.0 10=1.9 10e二、朗伯二、朗伯-比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件1. 单色光：单色光：应选用应选用 max处或肩峰处处或肩峰处 测定测定2. 吸光质点形式不变吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件应控制条件(酸度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等)3. 稀溶液稀溶液(一般一般104*选择性好选择性好*显色剂在测定波长处

3、无明显吸收。显色剂在测定波长处无明显吸收。 对照性好对照性好, 对比度对比度 max60nm。*反应生成的有色化合物反应生成的有色化合物组成恒定，稳定组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，显色条件易于控制，重现性好重现性好。： ：助色团助色团nh2，oh，x （孤对电子）（孤对电子）neo生色团生色团：nn，no，oc=s,n （共轭双键）（共轭双键）e无机显色剂无机显色剂: scn- fe(scn)2+ h2o2 tioh2o22+有机显色剂有机显色剂:有机显色剂有机显色剂ch3ccch3 hon noh nnohcoohso3hoo型：型：nnnoh ohon型型：吡啶偶氮间苯二酚吡啶偶氮间

4、苯二酚(par)nh nhnsns型型：双硫腙双硫腙nn型：型：丁二丁二酮肟酮肟(ni2+)邻二邻二氮菲氮菲(fe2+)磺基水杨酸磺基水杨酸 -fe3+a.三元混配络合物：三元混配络合物：nb-5-br-padap-酒石酸，v-par-h2o2b.离子缔合物：离子缔合物： aucl4-罗丹明b主要用于萃取光度测定主要用于萃取光度测定c.金属离子络合剂表面活性剂体系：金属离子络合剂表面活性剂体系： aui4-ctmabd.杂多酸：杂多酸：hsa-siwspectroscopy and spectral analysisvol.24,no.12,pp1630-1633,december,2004c

5、hinese journal of applied chemistryvol.20,no.9,pp833-837,sep.20041. 显色反应酸度显色反应酸度（c(m)、 c(r)一定）一定）ph1phph2ph9.2.2 9.2.2 显色条件的选择显色条件的选择c(r)c(r)c(r)2. 显色剂用量显色剂用量（c(m)、ph一定）一定）mo(scn)32+ 浅红浅红mo(scn)5 橙红橙红mo(scn)6- 浅红浅红fe(scn)n3-n3. 显色温度及显色时间显色温度及显色时间t1()t2()t(min)a4.溶剂溶剂有机溶剂有机溶剂: 降低有色化合物的解离度，降低有色化合物的解离度

6、，提高显色反提高显色反应的灵敏度应的灵敏度 影响有色络合物的溶解度和组成，影响有色络合物的溶解度和组成，提高提高显色反应的速率显色反应的速率co2, fe3+co2+fef63-co(scn)2 (蓝蓝)nafscnco2+fe2+,sn4+(2)sn2+co(scn)2scn测测co2(含含fe3+) : (掩蔽法掩蔽法)(1)(1)化学法化学法 co2+, zn2+,ni2+, fe2+ cor,znr nir,fercor, zn2+ ,ni2+ , fe2+ 钴试剂钴试剂rh+测测co2 :(生成络合物性质不同生成络合物性质不同)如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，如不能通过控制酸

7、度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。则需采取分离法。测测fe3:(控制控制ph)fe3+, cu2+fess （紫红）（紫红）cu2+ph 2.5ss(2) 物理法物理法 选择适当的测定波长选择适当的测定波长515655415500钍-偶氮砷iii 钴-亚硝基红盐 aa络合物络合物络合物络合物试剂试剂试剂试剂 1. 1. 仅络合物有吸收，仅络合物有吸收，溶剂溶剂作参比。作参比。 如如 phenphenfefe2+2+ 标准曲线标准曲线2.2.待测液也有吸收待测液也有吸收，被测液被测液作参比。作参比。 如如 测汽水中的测汽水中的 fefe3. 3. 显色剂或其他试剂也有吸收，显色剂或其他试剂

8、也有吸收，空白溶液空白溶液作参比作参比 例例: :邻二氮菲光度法测邻二氮菲光度法测li2co3中的中的 fe， 参比溶液为不含参比溶液为不含li2co3样品的所有试剂样品的所有试剂。4. 4. 干扰组分与显色剂有反应干扰组分与显色剂有反应, ,又无法掩蔽消除时：又无法掩蔽消除时： 1 1）掩蔽被测组分掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比，再加入显色剂，作参比. .2 2）加入等量干扰组分加入等量干扰组分到空白溶液中到空白溶液中, ,作参比作参比. . - - 选择适当的参比溶液选择适当的参比溶液1 测定波长选择测定波长选择选择原则：选择原则： “吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性

9、9.2.3 测量波长和吸光度范围的选择测量波长和吸光度范围的选择2 测定浓度控制测定浓度控制控制浓度控制浓度 吸光度吸光度a：0.20.8减少测量误差减少测量误差9.2.4 参比溶液的选择参比溶液的选择仪器调零仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射和吸收消除吸收池壁和溶液对入射光的反射和吸收 扣除干扰扣除干扰试剂空白试剂空白试样空白试样空白褪色空白褪色空白 9.2.5 标准曲线制作标准曲线制作0123456780.000.050.100.150.200.250.300.35aconcentration理论基础：朗伯理论基础：朗伯-比尔定律比尔定律 标准（工作）曲线绘制标准（工作）曲线绘制方法

10、：方法：在在 、b固定的情况固定的情况下，测定一系列不同浓度下，测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，作的标准溶液的吸光度，作ac图，在相同条件下测定图，在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从曲样品溶液的吸光度，从曲线上可查出被测样品的浓线上可查出被测样品的浓度。度。the linearity relation of scavenging effect of hydroxyl radical with aqueous extraction from eleochairis toberosa peel 9.3 9.3 光度分析法的误差光度分析法的误差不过原点：不过原点：发生偏离：发生偏离： 复合光

11、由复合光由 1和和 2组成，对于浓度不同的溶液组成，对于浓度不同的溶液a和和b，引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光，引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲向下弯曲。 9.3.1 非均匀介质非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系吸光度增加，导致线性关系上弯上弯2 物理化学因素物理化学因素离解、缔合、异构等离解、缔合、异构等如：如：cr2o72-+h2o-=2hcro4- =2h+2cro42- par的偶氮醌腙式的偶氮醌腙式 化学反应化学反

12、应吸光度标尺刻度不均匀吸光度标尺刻度不均匀9.3.2 吸光度测量的误差吸光度测量的误差 dc/c= da/a=dt/(tlnt) er=dc/c100= da/a100=dt/tlnt100p326 p3271086420204060800.70.40.20.1at%err0.434lg(0.01)ctecttt(36.8)0.434浓度测浓度测量的相量的相对误差对误差er与与t(或或a)的关系的关系实际工作中，应控制实际工作中，应控制t在在15%65, a在在0.20.8之间之间 (调调c, b, )，相对误差相对误差4% 1.示差吸光光度法示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度目

13、的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高解决高(低低)浓度组分浓度组分(a在在0.20.8以外以外)问题问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法精密差示吸光度法特点：特点： 以标准溶液作参比溶液以标准溶液作参比溶液原理：原理： a相对相对 = a = bcx- bc0= b c准确度：读数标尺扩展准确度：读数标尺扩展, 相对误差减少相对误差减少 c0愈接近愈接近cx, 准确度提高愈显著准确度提高愈显著 结果计算：结果计算：cx = c0 + c9.4 9.4 常用的吸光光度法常用的吸光光度法例：例：用普通分光光度法测得标液用普通分光光度

14、法测得标液c1的透光率为的透光率为20%，试液的透光率为试液的透光率为12%，若以示差法测定，以，若以示差法测定，以c1为参比，为参比，则试液的透光率为则试液的透光率为 a. 40% b.50% c.60% d.70% 答案：答案：c.60%1. 单一组分测定单一组分测定1) 金属离子金属离子: fe-phen, ni-丁二酮肟丁二酮肟, co-钴试剂钴试剂2) 磷的测定磷的测定: dna中含中含p9.2%, rna中含中含p9.5%, 可得核酸量可得核酸量.h3po4+12(nh4)2moo4+21hno3=(nh4)3po412moo3+12nh4no3+12h2o磷钼黄磷钼黄( 小小)磷

15、钼磷钼(v)蓝蓝( 大大)sn2+9.5 9.5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用3) 蛋白质测定蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等溴甲酚绿、考马司亮蓝等4) 氨基酸测定氨基酸测定茚三酮茚三酮(紫色化合物紫色化合物)5) 水质检测水质检测: nh4+、no2-、mn2+、fe2+、so42-、hg2+-6) 药物含量测定药物含量测定比吸光系数定量；荷移比吸光系数定量；荷移光谱法测定光谱法测定.7) 紫外吸收紫外吸收(uv): no2-、no3-、so42-、so32-、co32-、scn-、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。、苯丙氨酸、蛋白质等。2. 多组分的测定多组分的测定

16、x 1, y 1, x 2, y 2由由x,y标液标液 在在 1, 2处分别测得处分别测得a) 在 1处测组分处测组分x, 在 2处测组分处测组分yb) 在 1处测组分处测组分x; 在在 2处测总吸处测总吸收收,扣除扣除x吸收吸收,可求可求yc) x,y组分不能直接测定组分不能直接测定a1= x 1bcx+ y 1bcy(在 1处测得处测得a1) a2 = x 2bcx+ y 2bcy(在 2处测得处测得a2)3. 测定弱酸和弱碱的离解常数测定弱酸和弱碱的离解常数 ahb和ab-分别为有机弱酸hb在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以hb或b-形式存在。hb h+ + b- h+b-ka

17、 = hbpka=ph+ lg hbb-a=ahb+ab-pka=ph - lg ahb - aa- ab-lg a hb - aa- ab-对对ph作图即可求得作图即可求得pka p133(5-30)：4. 络合物组成确定络合物组成确定 饱和法（摩尔比法）饱和法（摩尔比法）制备一系列含钌制备一系列含钌3.010-5 mol/l (固定不变固定不变)和不和不同浓度（小于同浓度（小于12.010-5 mol/l）的）的pdt溶液，按溶液，按实验条件，实验条件，485nm测定吸光度测定吸光度,作图。作图。pdt:ru=2:1等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法固定固定m+l,改变改变m,获得一系列吸光

18、度值，吸获得一系列吸光度值，吸光度最大的值所对应的光度最大的值所对应的m与与l的比值，即获得的比值，即获得m:l比值。比值。co(iii)与与3，5二氯二氯padat的比值为的比值为1:2平衡移动法平衡移动法固定固定m,不断改变不断改变l，以，以lgmln/m为纵坐标，为纵坐标，lgl为横坐标，作图，斜率为横坐标，作图，斜率n即是络合物中即是络合物中l:m的的比值；纵轴上的截距比值；纵轴上的截距lgk是络合物的稳定常数。是络合物的稳定常数。lgk+nlgl=lg(mln/m) mln k = mlnlgk+nlgl=lga/(amax-a)9.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系了解分子对光

19、的吸收与溶液颜色的关系. 吸收曲线吸收曲线定性分析的基础。定性分析的基础。 定量分析的基础定量分析的基础朗伯朗伯-比尔定律：比尔定律：a= bc=-lgt 式中式中 各参数的物理意义，定量计算。各参数的物理意义，定量计算。9.2 了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本部件。基本部件。9.3 灵敏度的表示灵敏度的表示摩尔吸光系数的意义和计算摩尔吸光系数的意义和计算；准确度准确度适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。9.4 显色反应及条件的确定显色反应及条件的确定: 显色剂用量、酸度、时间、显色剂用量、酸度

20、、时间、温度、干扰及消除。温度、干扰及消除。9.5 应用应用: 单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。第第9章章 小小 结结第四节第四节 光度分析的步骤光度分析的步骤一、显色剂的选择一、显色剂的选择（1）反应的选择性好，干扰少，或干扰容）反应的选择性好，干扰少，或干扰容 易消除。易消除。（2）生成的有色化合物有较高的摩尔吸光）生成的有色化合物有较高的摩尔吸光 系数，灵敏度足够高，适用于试样中系数，灵敏度足够高，适用于试样中 待测物质的含量范围。待测物质的含量范围。二、实验条件的

21、选择二、实验条件的选择（一）溶液的酸度（一）溶液的酸度酸度直接影响显色剂的浓度和生成物的酸度直接影响显色剂的浓度和生成物的颜色。颜色。（二）显色剂用量（二）显色剂用量 为了使显色反应进行完全，需加入过量为了使显色反应进行完全，需加入过量 显色剂，在实际工作中，通常根据试验显色剂，在实际工作中，通常根据试验 来确定。来确定。（三）显色时间及颜色的稳定性三）显色时间及颜色的稳定性 必须通过试验来确定在最合适的时间内必须通过试验来确定在最合适的时间内进行测定。进行测定。（四）温度（四）温度 大多数的显色反应在室温下进行，但有大多数的显色反应在室温下进行，但有些显色反应必须加热至一定的温度和一些显色反

22、应必须加热至一定的温度和一定时间才能完成。定时间才能完成。（五）溶剂（五）溶剂 有机溶剂对显色反应的影响为：有机溶剂对显色反应的影响为：（1）影响络合物的离解度；）影响络合物的离解度；（2）影响反应速度。）影响反应速度。（六）干扰物质的影响及消除方法（六）干扰物质的影响及消除方法（1）干扰物质本身有颜色或与显色剂）干扰物质本身有颜色或与显色剂 形成有色化合物，在测量条件下形成有色化合物，在测量条件下 也有光吸收。也有光吸收。 （2）在显色条件下，干扰物质析出沉）在显色条件下，干扰物质析出沉 淀或使溶液混浊，以致无法进行淀或使溶液混浊，以致无法进行 光度测量。光度测量。（3）与待测离子形成更稳定

23、的络合。）与待测离子形成更稳定的络合。 消除办法：消除办法：（1）控制酸度；）控制酸度；（2）加入适当掩蔽剂；）加入适当掩蔽剂；（3）选择适当的测量波长；）选择适当的测量波长；（4）选择适当的参比溶液。）选择适当的参比溶液。三、分析波长的选择三、分析波长的选择（1）如果不存在其它有色物质的干）如果不存在其它有色物质的干 扰，则选择待测有色物（或显色扰，则选择待测有色物（或显色 剂生成的产物）的最大吸收波长剂生成的产物）的最大吸收波长 的光波作为入射光进行光度测的光波作为入射光进行光度测 定。定。（2）如果显色剂本身有颜色，且在有）如果显色剂本身有颜色，且在有 色物质的最大吸收波长下也有光色物质

24、的最大吸收波长下也有光 吸收，最好选择有色物质有较大吸收，最好选择有色物质有较大 光吸收的波长而显色剂（或其它光吸收的波长而显色剂（或其它 有色物质）在此波长下的光吸收有色物质）在此波长下的光吸收 为零的单色光作为入射光。为零的单色光作为入射光。四、参比溶液的选择四、参比溶液的选择（1）当试液本身及显色剂均无色，可用）当试液本身及显色剂均无色，可用 蒸镏水蒸镏水作参比溶液。作参比溶液。（2）显色剂无色，但待测试液中有其它）显色剂无色，但待测试液中有其它 有色物质存在，可采用有色物质存在，可采用不加显色剂不加显色剂 的待测试液的待测试液作参比溶液。作参比溶液。（3）如显色剂有颜色，则要用）如显色

25、剂有颜色，则要用试剂空白试剂空白 （不加试样溶液）（不加试样溶液）作参比溶液。作参比溶液。（4）如显色剂和试液均有颜色，则可）如显色剂和试液均有颜色，则可 取两份试液，其中一份先加入适取两份试液，其中一份先加入适 当掩蔽剂将待测组分掩蔽使之不当掩蔽剂将待测组分掩蔽使之不 与显色剂作用，然后两份试液都与显色剂作用，然后两份试液都 加入显色剂及其它试剂，将加入加入显色剂及其它试剂，将加入 掩蔽的那份试液掩蔽的那份试液作参比溶液。作参比溶液。五、标准曲线的制作五、标准曲线的制作 配制一系列不同含量的标准溶液，分配制一系列不同含量的标准溶液，分 别置于比色皿内，选择合适的入射光别置于比色皿内，选择合适

26、的入射光 波长，用参比溶液调整光度计的零波长，用参比溶液调整光度计的零 点，然后把入射光照射到盛有标准溶点，然后把入射光照射到盛有标准溶 液的比色皿上，测得吸光度值。根据液的比色皿上，测得吸光度值。根据 标准溶液中标准溶液中 待测组分的量对吸光度作待测组分的量对吸光度作 图得一直线叫标准曲线。图得一直线叫标准曲线。 测量的吸光度最好在：测量的吸光度最好在：0.2 - 0.8 范范 围内围内 第五节第五节 朗伯朗伯-比耳定律的偏离比耳定律的偏离一、非单色光引起的偏离一、非单色光引起的偏离 朗伯朗伯-比耳定律只适用于单色光，比耳定律只适用于单色光，单色光的纯度与仪器的质量有关，性能单色光的纯度与仪器的质量有关，性能好的分光光度计，所得的入射光的波长好的分光光度计，所得的入射光的波长范围较窄，即范围较窄，即“单色光单色光”纯度较高，标纯度较高，标准准曲线的线性范围也大。曲线的线性范围也大。二、溶液本身的化学因素引起的偏离二、溶液本身的化学因素引起的偏离（一）溶液中的化学反应（一）溶液中的化学反应（