疟原虫镜检技术

1、疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术 采集血样采集血样 血片的制作与染色血片的制作与染色 原虫镜检原虫镜检 1.1.白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法 2. 2.原虫形态鉴定原虫形态鉴定显微镜检查疟原虫技术显微镜检查疟原虫技术采集血样采集血样采集血样涂片时，首先要核对患者的采集血样涂片时，首先要核对患者的姓名和年龄姓名和年龄采集血样采集血样采血部位：采血部位：耳垂耳垂或无名指，或无名指，取血方法：取血方法：通常在耳垂取血，通常在耳垂取血，先用先用75%75%酒精棉球消毒取血酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，

2、右手持消毒针无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。挤压出血。厚血膜厚血膜 用推片的一角，从取血用推片的一角，从取血部位刮取约部位刮取约4微升血量（相微升血量（相当于火柴头大小），使血当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，再由里向外一个方向旋转，转转24圈，涂成直径圈，涂成直径0.81厘厘米大小圆形厚血膜米大小圆形厚血膜薄血膜薄血膜再取一小滴血再取一小滴血.将血置于将血置于第一张玻片离厚血膜适第一张玻片离厚血膜适 当当远的地方远的地方.将将 推片的边缘紧

3、推片的边缘紧贴载玻片，轻轻上下移动，贴载玻片，轻轻上下移动，使血液沿边缘散开，然后使血液沿边缘散开，然后匀速地向前推进，形成薄匀速地向前推进，形成薄而平铺的薄血膜而平铺的薄血膜血片制作血片制作厚血膜厚血膜薄血膜薄血膜制片流程图示制片流程图示标签标签标准的疟疾厚薄血膜片标准的疟疾厚薄血膜片黎莉莉黎莉莉云南云南2011.7 厚血膜厚血膜 血量：血量：4微升微升 位置：玻片右位置：玻片右1/3处处 外形：圆形，直径外形：圆形，直径0.81.0cm 薄薄血膜血膜 血量：血量：1-1.51-1.5微升，微升， 位置：玻片位置：玻片1/21/2 外形：薄度均匀、无划痕、舌状外形：薄度均匀、无划痕、舌状,

4、, 长约长约2.0-2.5cm2.0-2.5cm 显微镜下：红细胞单层排列显微镜下：红细胞单层排列血片染色血片染色 吉氏染色法吉氏染色法 1. 染色液配制染色液配制 2. 门诊染色门诊染色 3. 成批染色和溶血染色成批染色和溶血染色 瑞氏染色法瑞氏染色法 WHO推荐使用吉氏染色法推荐使用吉氏染色法稀释吉氏染色液稀释吉氏染色液吉氏原液需经缓冲液（吉氏原液需经缓冲液（PH7.0）或净水）或净水（自来水、矿泉水（自来水、矿泉水 、井水等）稀释后，、井水等）稀释后，方可用于厚薄血片染色。方可用于厚薄血片染色。 吸取原液时，不要晃动瓶子吸取原液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物以免沉淀物泛起影响染色效果泛起影

5、响染色效果.血片染色血片染色（单张或少量染色）（单张或少量染色）用甲醇固定用甲醇固定薄血膜，平薄血膜，平放，等待厚放，等待厚血膜血膜充分干充分干燥燥（要点：载要点：载玻片略向下玻片略向下倾斜。甲醇倾斜。甲醇不能触碰到不能触碰到厚血膜厚血膜）黎莉莉黎莉莉云南云南2011.7 在量筒内量在量筒内量2ml缓缓液或净水，液或净水， 滴加滴加吉氏原液吉氏原液4滴（每滴（每毫升毫升2滴）滴），混匀，混匀，然后滴在已充分干然后滴在已充分干躁的厚薄血膜上，躁的厚薄血膜上，染色染色30min。清水。清水缓缓冲洗，晾干缓缓冲洗，晾干（厚血膜朝下内（厚血膜朝下内面），等待镜检。面），等待镜检。血片染色血片染色黎莉莉

6、黎莉莉云南云南2011.72011.7要点：配制的染色液必要点：配制的染色液必须在半小时内使用须在半小时内使用将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染吉氏染液（液（3毫升吉氏染色液加缓冲液或净水毫升吉氏染色液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸毫升，混匀）浸没血片，染色没血片，染色30分钟。然后用清水轻轻将染液漂洗干净，分钟。然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检（如果染色将染色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检（如果染色效果不理想时，得酌情增减染色时间和浓度）。效果不理想时，得酌情增减染色时间和浓度）。 成批血片染色成批血片染

7、色厚血膜溶血染色厚血膜溶血染色放置多时放置多时未染色的血片（未染色的血片（3天以上，薄片已用甲天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部溶解后用行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色吉氏染色液染色液染色30分钟。然后用清水漂洗干净分钟。然后用清水漂洗干净,晾干。晾干。染色质量标准染色质量标准 显微镜下显微镜下：疟原虫核呈红色：疟原虫核呈红色, 胞浆呈蓝色，薄血膜的红细胞浆呈蓝色，薄血膜的红细 胞单层排列，视野干净。胞单层排列，视野干净。 外观：外观：标准颜色应为：血膜蓝中带紫色。如果血膜颜色偏红色标准颜色应为：血膜

8、蓝中带紫色。如果血膜颜色偏红色, 说明染色偏酸性；血膜偏蓝色说明染色偏酸性；血膜偏蓝色, 则为偏碱性。则为偏碱性。外观吉氏染色血片外观吉氏染色血片偏偏 酸酸偏偏 碱碱标标 准准显微镜下显微镜下血片制作与染色注意事项血片制作与染色注意事项 载玻片必须清洁无油污载玻片必须清洁无油污 固定薄血膜时，甲醇不要触碰到厚血膜。固定薄血膜时，甲醇不要触碰到厚血膜。 涂制血片顺序，从右至左，先涂制厚血膜，涂制血片顺序，从右至左，先涂制厚血膜，再涂制薄血膜。再涂制薄血膜。 放置放置3天以上的血片，在染色之前先用清水天以上的血片，在染色之前先用清水滴加在厚血膜上进行溶血，再进行染色。滴加在厚血膜上进行溶血，再进行

9、染色。 厚血膜干燥时，不要高温加热。厚血膜干燥时，不要高温加热。充分干燥充分干燥后方可染色。后方可染色。已稀释的吉氏染液，须在已稀释的吉氏染液，须在30分钟内用完。分钟内用完。疟原虫镜检疟原虫镜检 疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 疟原虫密度计数方法疟原虫密度计数方法 人体四种疟原虫的形态特征人体四种疟原虫的形态特征当前分子生物学、血清学技术快速发展当前分子生物学、血清学技术快速发展,但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替 代的确诊疟疾的代的确诊疟疾的 “金标准金标准” 显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴别别4

10、种人体疟原虫种人体疟原虫原虫镜检原虫镜检-金标准金标准疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 厚血膜 薄血膜 优点优点血量多，面积小，一个厚血量多，面积小，一个厚血膜的血量相当于血膜的血量相当于20张薄张薄血片。血片。原虫检出率高原虫检出率高经甲醇固定，红细胞完经甲醇固定，红细胞完整，原虫形态改变不大，整，原虫形态改变不大，原虫易于辨认原虫易于辨认 缺点缺点原虫在干燥过程中皱缩，原虫在干燥过程中皱缩，红细胞消失，原虫变形较红细胞消失，原虫变形较大，大，原虫鉴定困难原虫鉴定困难血量比厚血膜少许多，血量比厚血膜少许多，但面积是厚血膜的但面积是厚血膜的8-10倍。检查费时，倍。检查费时

11、，原虫检原虫检出率较低出率较低用途用途用于疟疾病人检查用于疟疾病人检查原虫虫种、虫期鉴定及原虫虫种、虫期鉴定及初学者教学标本初学者教学标本白细胞原虫密度计数用途白细胞原虫密度计数用途 确定患者原虫感染程度确定患者原虫感染程度 抗疟后考核原虫密度抗疟后考核原虫密度 课题研究课题研究疟原虫密度计算疟原虫密度计算 白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法(厚血膜厚血膜 WHO) 优点：可作为定性和定量分析优点：可作为定性和定量分析 半定量计数法半定量计数法 (厚血膜厚血膜) 优点：方法简便优点：方法简便 缺点：只能定性，不宜作为定量分析缺点：只能定性，不宜作为定量分析 红细胞感染密度计算法红细胞感染

12、密度计算法(薄血膜薄血膜)显微镜下厚血膜读片顺序显微镜下厚血膜读片顺序白细胞原虫密度计数读片白细胞原虫密度计数读片在显微镜里在显微镜里读片检查时读片检查时从厚血膜的从厚血膜的上缘开始，上缘开始，由上而下，由上而下，自左至右，自左至右，由右至左，由右至左，一行接一行，一行接一行，一个视野连一个视野连接一个视野，接一个视野，按顺序查完按顺序查完整个血膜。整个血膜。 不需要计数的视野不需要计数的视野 需要进行白细胞、需要进行白细胞、疟原虫计数的视野疟原虫计数的视野如果该视野无原虫，如果该视野无原虫，则计数白细胞数，反则计数白细胞数，反之亦然。之亦然。 看到第一个疟原看到第一个疟原虫，计数开始虫，计数

13、开始白细胞原虫密度计数方法白细胞原虫密度计数方法 按视野顺序，按视野顺序，从看到第一个疟原虫计数开始从看到第一个疟原虫计数开始，记录记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数如果原虫密度较低，可增加白细胞计数500 1 000 个。个。 白细胞疟原虫计算公式：白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数疟原虫数 计数的白细胞数计数的白细胞数 患者每微升血白细患者每微升血白细胞数胞数 = 疟原虫数疟原虫数/l血。血。 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 000个白个白细胞计数细胞

14、计数(国际标准国际标准) 。白细胞疟原虫密度计数法白细胞疟原虫密度计数法白细胞疟原虫计数法白细胞疟原虫计数法例如例如 计数计数200 WBC中有中有35个疟原虫，在不知患个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血者白细胞数的情况下，以每微升血8 000个白细个白细 胞计数胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（计数的疟原虫数）（计数的疟原虫数）200（计数的白细胞）（计数的白细胞）x 8000（每微升血白细胞数）（每微升血白细胞数） =1400 / l答：该患者的疟原虫密度为答：该患者的疟原虫密度为1400 / l。用厚血膜每个视野中所观察到疟

15、原虫的平均数粗略地估用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估算出疟原虫密度。此方法将密度分为算出疟原虫密度。此方法将密度分为6级：级：1.全厚血膜查见疟原虫数在全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野个以上，但平均每个视野不到不到1个虫，记录个虫，记录“少少”3.平均每个视野平均每个视野15个虫，记录个虫，记录“”4.平均每个视野平均每个视野610个虫，记录个虫，记录“+”5. 平均每个视野平均每个视野11100个虫，记录个虫，记录“+ ”6. 平均每个视野平均每个视野100个虫以上，记

16、录个虫以上，记录“+ ”。 如：如：Pv R+T+G少少 这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，响，只能定性，不宜作定量分析只能定性，不宜作定量分析。半定量计数法半定量计数法如何确定疟原虫血片为阴性如何确定疟原虫血片为阴性 检查全部厚血膜视野未查见疟原虫检查全部厚血膜视野未查见疟原虫 最少检查最少检查100个厚血膜视野未查见个厚血膜视野未查见 疟原虫（临床病人）疟原虫（临床病人）人体四种疟原虫的分布人体四种疟原虫的分布疟原虫镜检疟原虫镜检感染人的疟原虫有四种感染人的疟原虫有四种: 恶性疟原虫恶性疟原虫 P. falciparum （P.

17、f.）间日疟原虫间日疟原虫 P. vivax (P.v.)三日疟原虫三日疟原虫 P. malariae (P.m.)卵形疟原虫卵形疟原虫 P. ovale (P.o.)恶性疟恶性疟 P.falciparum 分布热带、亚热带地区，是非洲的重要疾病分布热带、亚热带地区，是非洲的重要疾病 我国流行区域为云南省和海南省我国流行区域为云南省和海南省 四种疟原虫中致病力最强四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者，无免疫力者 感染感染后出现急性症状后出现急性症状,不及时治疗可不及时治疗可危及生命（脑危及生命（脑型疟）型疟）间日疟间日疟 P.vivax 间日疟原虫分布于我国大部分地区间日疟原虫分布于我国大部分地

18、区, 中部中部 地区病例较多地区病例较多 病程良性病程良性, 有复发有复发 遍布全球温带地区及大片热带地区遍布全球温带地区及大片热带地区三日疟三日疟 P.malariae 遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，呈片状、遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，呈片状、块状分布块状分布三日疟在我国非常少见，只在南方有散在报告三日疟在我国非常少见，只在南方有散在报告卵形疟卵形疟 （蛋形疟）（蛋形疟） P.ovale 主要分布非洲。缅甸、东南亚有散在报告主要分布非洲。缅甸、东南亚有散在报告 在我国卵形疟消灭在我国卵形疟消灭 四种疟原虫形态特征四种疟原虫形态特征 红细胞不涨大红细胞不涨大环状体纤细环状

19、体纤细, 常见多常见多重感染，环状体重感染，环状体内内可有可有2个核个核 环状体可贴在红细环状体可贴在红细胞边缘胞边缘 血片中只有环状体血片中只有环状体和配子体期原虫和配子体期原虫配子体呈新月形或配子体呈新月形或腊肠形腊肠形成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含16-32个裂殖子个裂殖子可出现茂氏点可出现茂氏点恶性疟（恶性疟（P.falciparum） 鉴定要点鉴定要点红细胞明显涨红细胞明显涨大大 ，可达正常，可达正常红细胞的红细胞的1.5-2倍倍薛氏点明显薛氏点明显 环状体较大环状体较大滋养体胞浆有滋养体胞浆有阿米巴样伪足阿米巴样伪足血片中可见各血片中可见各期的原虫形态期的原虫形态成熟裂殖体约成熟裂殖

20、体约含含12-24个裂殖个裂殖子子 间日疟（间日疟（P. vivax ） 鉴定要点鉴定要点红细胞不红细胞不涨大或略涨大或略小小环状体可环状体可呈方形呈方形胞浆不活胞浆不活跃呈带状跃呈带状形形 成熟裂殖成熟裂殖体呈菊花体呈菊花状状,内含内含6-12个裂殖个裂殖子子 核可能出核可能出现在环状现在环状体边缘体边缘 三日疟（三日疟（P.malariae） 鉴定要点鉴定要点卵形疟（卵形疟（P. ovale） 鉴定要点鉴定要点红细胞正常红细胞正常或略涨大或略涨大 2. 虫体呈椭圆形虫体呈椭圆形 有慧星状有慧星状 (也称也称齿轮状齿轮状)3. 薛氏点明显薛氏点明显 4. 成熟滋养体类成熟滋养体类似三日疟，似

21、三日疟，但原虫更粗但原虫更粗大大5. 成熟裂殖体约成熟裂殖体约含含6-12个裂个裂殖子殖子 恶性疟原虫形态特征恶性疟原虫形态特征被寄生的红细胞不涨大被寄生的红细胞不涨大外周血液中只能查见环状体和配子体外周血液中只能查见环状体和配子体配子体呈现新月形或腊肠形配子体呈现新月形或腊肠形茂氏点数量较少，颗粒较大茂氏点数量较少，颗粒较大裂殖子数通常为裂殖子数通常为16-32个个间日疟原虫形态特征间日疟原虫形态特征被寄生的红细胞明显涨大被寄生的红细胞明显涨大外周血液中可见各期疟原虫外周血液中可见各期疟原虫滋养体有阿米巴样伪足滋养体有阿米巴样伪足薛氏点数量多，颗粒较小薛氏点数量多，颗粒较小裂殖子数量裂殖子数

22、量12-24三日疟原虫形态特征三日疟原虫形态特征被寄生红细胞不涨大或缩小被寄生红细胞不涨大或缩小 原虫细胞浆呈条带状或方形原虫细胞浆呈条带状或方形成熟裂殖体呈菊花状成熟裂殖体呈菊花状裂殖子数通常为裂殖子数通常为6-12个个齐氏点（西门氏点）较少见齐氏点（西门氏点）较少见卵形疟原虫形态特征卵形疟原虫形态特征被寄生红细胞正常大小或略涨大，边被寄生红细胞正常大小或略涨大，边缘呈彗星状也称齿轮状缘呈彗星状也称齿轮状疟原虫通常呈椭圆形疟原虫通常呈椭圆形薛氏点与间日疟相似薛氏点与间日疟相似裂殖子数通常为裂殖子数通常为6-12 四种人体疟原虫都有双核和多重感染现象四种人体疟原虫都有双核和多重感染现象 间日疟

23、、三日疟和卵形疟在外周血液里间日疟、三日疟和卵形疟在外周血液里 能查见各期疟原虫能查见各期疟原虫 恶性疟在外周血液里只能查见环状体和恶性疟在外周血液里只能查见环状体和 配子体配子体混合感染混合感染 在一个血膜上有在一个血膜上有2种以上疟原虫感染称为种以上疟原虫感染称为混合感染，较常见的是间日疟原虫与恶性混合感染，较常见的是间日疟原虫与恶性疟原虫混合。疟原虫混合。 镜检判断镜检判断P.v+P.fP.v+P.f混合感染混合感染, ,必须是看到必须是看到 P.v P.v各期原虫和各期原虫和P.fP.f的配子体。的配子体。厚血膜中容易被误认为疟原虫的物质厚血膜中容易被误认为疟原虫的物质 未成熟的网织红

24、细胞溶血后的残影易未成熟的网织红细胞溶血后的残影易 被误为薛氏点被误为薛氏点 重叠的血小板易被误为裂殖体重叠的血小板易被误为裂殖体 混杂在稀释液中的细菌、植物孢子、混杂在稀释液中的细菌、植物孢子、 藻类及血液中的其他寄生虫，如血孢子虫藻类及血液中的其他寄生虫，如血孢子虫 等，会干扰对疟原虫的鉴别。等，会干扰对疟原虫的鉴别。镜检示教镜检示教 以下血片采自现症病例以下血片采自现症病例This is a thin film from a 27 year old female backpacker, with a recent history of trekking through Northern

25、Thailand and high fever. A typical Plasmodium falciparum presentation.Numerous fine ring forms Double chromatin dots Marginal forms Red cells are not enlargedA thin film from a 22 year old male holidaying in Lombok (Indonesia) one month previously. Intermittent fevers since returning. A typical Plasmodium vivax presentationSalient features are: Developing and thick (signet) ring forms Enlarged red cells Recent travel in Africa. Pyrexia of unknown origin. A typical Plasmodium ovale presentation Developing form of plasmodium Comet-like red cells Enlarged red cell Female patien