第五章 凝胶层析

1、1第五章第五章 凝胶层析凝胶层析(Gel chromatography)12凝胶层析凝胶层析（gel chromatography）常出现多种名称 ： 如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。凝胶层析的定义：凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。3凝胶层析的应用范围：凝胶层析的应用范围： 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热原和脱色。凝胶

2、层析的优点凝胶层析的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。4凝胶层析凝胶层析gel-filtration chromatography凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则5凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛，凝胶离的

3、层析技术，又称为分子筛，凝胶/分子筛排阻分子筛排阻层析。层析。 凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及除去热原物质分离纯化。以及除去热原物质分离纯化。 操作简便，分离效果好，重复性高，回收率高，操作简便，分离效果好，重复性高，回收率高，分离条件温和。分离条件温和。6凝胶层析的特点凝胶层析的特点 1凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。 2分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100。 74应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质

4、、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102105Da；Sepharose类为105108Da。3分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。85分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。9 分子直径比凝胶最大孔隙分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻

5、直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即在凝胶颗粒之外，即全排全排阻阻；两种全排阻的分子即；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开使大小不同，也不能分开；它们下行速度都快。；它们下行速度都快。 分子直径比凝胶最小孔隙分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下同也不能分开；它们的下行速度都慢。行速度都慢。102 凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶Sephadex G-系列 聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列 琼脂糖凝胶Sepharose系列Superose系列11 葡聚糖凝胶的种类有葡聚

6、糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升。毫升。 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解。葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解。 湿态的葡聚糖可加热到湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受，干的则能耐受120高温。高温。 Sephadex LH是羟丙基化的是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤于非水溶

7、性溶质的凝胶过滤 。葡聚糖凝胶（ Sephadex ）1213 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分，数字代表干胶的百分比比 ）。）。 当温度高于当温度高于50时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联的

8、琼脂糖，其孔径大小和是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能分离范围与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。高温消毒。琼脂糖凝胶14 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从型号从P-2至至P-300共共10种（种（ 数字数字X1000就

9、就相当于该凝胶的排阻限度）。相当于该凝胶的排阻限度）。聚丙烯酰胺凝胶15凝胶介质的选用原则组别分离 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G-15、Bio-Gel P-2或P-4。16 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离。 该策略也是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。在层析

10、过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。分级分离17凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定恒定的操作压是恒流的先决条件18上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好，分离效果最佳。1919 凝胶层析凝胶层析(Gel chromatography) 分子筛层析分子筛层析、凝胶扩散层析、排阻层析、限、凝胶扩散层析、排阻层析

11、、限制扩散层析等。制扩散层析等。 是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分由于各组分流经体积流经体积的差异，使的差异，使不同分子量不同分子量的组分得以分离的层析方法。的组分得以分离的层析方法。2020 凝胶层析的分离过程是在装有凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。多孔物质填料的柱中进行的。 柱的总体积为柱的总体积为VA，它包括填，它包括填料的料的骨架体积骨架体积VGM，填料的孔，填料的孔体积体积Vi(内水体积内水体积)以及填料颗以及填料颗粒之间的体积粒之间的体积V0（外水体积外水体积）。）。 VA=V1+V0+VGM 2121凝

12、胶层析：l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外； 3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。2222 当具有一定分子量分布的高聚当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，物溶液从柱中通过时，较小的较小的分子在柱中停留时间比大分子分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长停留的时间要长，于是样品各，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，组分即按分子大小顺序而分开，最先收集的是最大的分子最先收集的是最大的分子。 Ve=V0+Vi Kd 23 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱

13、时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 2424（一）平衡排除理论（一）平衡排除理论 当溶质层流过一个填料颗料这段距离当溶质层流过一个填

14、料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。达到平衡。 平衡条件只是在流速很慢时的一个极平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。端情况。2525（二）（二）扩散分离理论扩散分离理论 溶质分子在流经色谱柱溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平固定相之间没有达到平衡，存在着衡，存在着流速依赖性流速依赖性。聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1流速为0.65ml/min；2流速为2.0ml/min溶剂为甲苯 2626（三）（三）流动分离理论流动分离理论 红细胞在毛血细管中流动红细胞在毛血细管中流动时比血浆流

15、得快时比血浆流得快. . 较大的分子较先通过或绕较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。能按其大小进行分离。 2727分离过程分离过程 三种不同分子量物三种不同分子量物质的混合样品用某质的混合样品用某种规格的凝胶柱进种规格的凝胶柱进行分离。行分离。 样品加入，以水或样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线即得洗脱曲线 。2828分离过程分离过程最先流出物质最先流出物质A，A分子量最大分子量最大，完全不能进，完全不能进入颗粒内部，入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过只能从颗粒间隙流过， “全排全排阻阻”。其流经体积最小，等于外水体积

16、。其流经体积最小，等于外水体积V0。最后流出物质最后流出物质C，它，它分子量最小分子量最小，其分子可以，其分子可以自由进出凝胶颗粒自由进出凝胶颗粒， “全渗入全渗入”。流经体积是。流经体积是外水体积与内水体积之和外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分排阻部分排阻”或或“部分渗入部分渗入”。流经体积流经体积Ve是全部外水体积加是全部外水体积加上内水体积的一部分，即上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi 2929分配系数分配系数Kd 排阻系数：排阻系数： 当

17、当Kd=1时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。，为全渗入。 当当Kd=0时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。，为全排阻。 0Kd1时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入，为部分渗入。3030物质的物质的Kd值值3131凝胶的结构和性质凝胶的结构和性质 一、一、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、三、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、四、琼脂糖类凝胶琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球五、多孔玻璃微球 (Bio-glas

18、) 六、疏水性凝胶六、疏水性凝胶（hydrophobic gels） 3232一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 商品名为商品名为Sephadex G类类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。聚糖。 再经再经3-氯氯-1，2-环氧丙烷为环氧丙烷为交联剂交联剂，形成三维网状结构，形成三维网状结构的高分子化合物。的高分子化合物。 其其交联度是通过交联剂的加交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的量及反应条件来控制的。 3333Sephadex G 编号意义：编号意义： 1、吸液量；、吸液量； 2、溶涨时间；、溶涨时间； 3、凝胶孔径凝胶孔径； 4、分离范围分

19、离范围3434葡聚糖凝胶性能与编号的关系葡聚糖凝胶性能与编号的关系编号交联度吸液量膨胀速度凝胶孔径分离限凝胶强度大（ Sephadex G150 ）小大慢大大小小（ Sephadex G 50 ）大小快小小大3535葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G类）的规格类）的规格3636保存保存 保存的方法有保存的方法有干法、湿法和半缩法干法、湿法和半缩法三种。三种。 湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（存（6个月以内）。个月以内）。 常用常用0.02%叠氮化钠叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、三氯叔丁醇、20%乙醇等。乙醇等。 干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处

20、理洗净的凝干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，脱水收缩，抽滤，用胶，脱水收缩，抽滤，用6080吹干。吹干。 半缩法：半缩法：这是以上两法的过渡法。即用这是以上两法的过渡法。即用 6070%的乙醇使凝胶部分脱水收缩，然后封口，置的乙醇使凝胶部分脱水收缩，然后封口，置 4 冰箱保存。冰箱保存。 3737二、修饰葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) （一）（一）亲脂性葡聚糖凝胶亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex） 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。羟丙基，使呈亲脂

21、性，同时保留亲水性。 （二）（二）交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex ion-exchanger） 将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。的各种交换剂。3838交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂3939 （三）（三）Supperdex系凝胶系凝胶 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。而成。 （四）（四）Sephacryl系凝胶系凝胶 是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。价交联制成的。 理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭理化稳

22、定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。菌。4040Supperdex系凝胶系凝胶4141Sephacryl系凝胶系凝胶4242三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶 商品名为商品名为生物凝胶生物凝胶-P（Bio-Gel P）。）。 该凝胶由该凝胶由丙烯酰胺丙烯酰胺组成；以组成；以亚甲亚甲基双丙烯酰胺为交联剂基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而，聚合而成。成。 特点特点： 1、无非特异吸附，保存方便；、无非特异吸附，保存方便； 2、编号反映出它的分离界限编号反映出它的分离界限。 4343聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的性质 生物凝胶的编号反映出它的分离界限。生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如如Bio-

23、Gel P-100。4444四、琼脂糖类凝胶四、琼脂糖类凝胶 ( (Sepharose) ) （一）琼脂糖凝胶（一）琼脂糖凝胶 结构是由结构是由-D-半乳糖半乳糖与与3，6-脱水脱水-L-半半乳糖乳糖以以-1，3-和和-1，4-糖苷键相间连糖苷键相间连接而成的链状分子。接而成的链状分子。4545琼脂糖凝胶特点琼脂糖凝胶特点 1、没有共价键的交联。、没有共价键的交联。 2、孔径孔径。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、非特异性吸附力低。、非特异性吸附力低。 5、分离范围大分离范围大。 6、颗粒强度差。颗粒强度差。4646琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖

24、凝胶有琼脂糖凝胶有3个规格：个规格：Sepharose2B、4B、6B分分别表示琼脂糖浓度为别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。4747（二）架桥琼脂糖凝胶（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL） 架桥琼脂糖凝胶为琼架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经脂线性分子经1，3-二二溴丙醇溴丙醇交联的凝胶。交联的凝胶。 它的凝胶孔径均匀，它的凝胶孔径均匀，机械强度机械强度明显加大。明显加大。 对热和化学物质的稳对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加定 性 大 大 增 加 , , 在在pH314范围内稳定范围内稳定。 4848Sepharose CL的性质 4949（三）超胶（三）超胶（Utro-g

25、el ACA） 所谓超胶是所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。5050 （四）（四） Superose系凝胶系凝胶 是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于HPLC的的高效高效凝胶过滤介质。凝胶过滤介质。 有有6%和和12%两个规格。两个规格。5151五、多孔玻璃微球五、多孔玻璃微球(Bio-glas) 特点：特点：1、化学稳定性高、化学稳定性高、强度大强度大。 2、对糖类、蛋白质等物

26、质有吸附作用对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其、编号表示其孔径孔径, 越大，分离分子量也越大。越大，分离分子量也越大。5252六、疏水性凝胶六、疏水性凝胶（hydrophobic gels） 聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 Styragel商品商品, , 分离范围为分离范围为1 60040 000 000。 生物珠生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的物），适于分离分子量较小的物质。质。 分离不溶水的有机物质分离不溶水的有机物质。5353常用的商品化凝胶介质 545455第三节第三节 凝胶层析的实验凝胶层析的实验条件和操作条件和

27、操作 555656第三节第三节 凝胶层析的实验条件和操作凝胶层析的实验条件和操作 一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作三、凝胶层析操作 四、主要参数测算四、主要参数测算 5757一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理 （一）凝胶的选择（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开将分子量极为悬殊的两类物质分开，如，如蛋白质与盐类，称作蛋白质与盐类，称作类分离类分离或组分离。或组分离。 (2).将分子量相差不大的大分子物质加以分将分子量相差不大的大分子物质加以分离离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做，如分离血

28、清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离分级分离。58 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。 59 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。 凝胶粒度与洗脱效果的关系图 60 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。

29、一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。 611 1类分离类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd1。这样能取得最好的分离效果。62例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间

30、。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是10005000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。632分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻

31、，另一个接近全渗入；64 第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的13。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。65 不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见右图）。66 凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽

32、。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。 67葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。6868（二）凝胶粒度的选择（二）凝胶粒度的选择(p98) 细粒凝胶柱流速低，洗细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄脱峰窄，分辨率高分辨率高，用，用于精制分离或分析。于精制分离或分析。

33、粗粒凝胶柱流速高，洗粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，脱峰平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。用于粗制分离，脱盐。6969（三）凝胶的预处理（三）凝胶的预处理 使用前须使用前须溶涨溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。并达到平衡。 干胶以干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶涨热法溶涨( (水浴水浴) )。7070二、凝胶层析柱的设计二、凝胶层析柱的设计和制备和制备 （一）层析柱的选择（一）层析柱的选择 层析柱长度与直径的比值称作层析柱长度与直径的比值称作“柱比柱比”。 对于类分离对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的，柱床体积一

34、般为样品溶液体积的5倍，倍，柱比柱比5:1到到10:1即可即可。 对于分级分离对于分级分离，则要求柱床体积大于样品体积，则要求柱床体积大于样品体积25倍以倍以上，甚至多达上，甚至多达100倍。倍。柱比在柱比在25至至100之间。之间。 柱床体积：层析柱中层析填料本身的体积以及填料内部和填料颗粒之间溶剂体积的总和。即层析柱固定相和流动相体积之和。 7171凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系 7272（二）凝胶柱的装填（二）凝胶柱的装填 常用的常用的支持物支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约空柱中应留约1/5的水或溶剂的水或溶剂. . 不断搅

35、拌下使胶粒不断搅拌下使胶粒均匀沉降均匀沉降，使不发生，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。凝胶分层和胶面倾斜。73 一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。 一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。74 层析柱层析柱 （a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液

36、进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子） 75 层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；2恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5可调螺旋夹；6.自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪7676（三）凝胶床的检查和维护（三）凝胶床的检查和维护 观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。 有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流，有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流，色带是否平整。色带是否平整。 检查物质为检查物质为蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖。 新装好的柱要检验其均匀性可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降

37、。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。 7777操作压操作压 层析柱由于进出口之层析柱由于进出口之间液位压力差形成的间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称对凝胶颗粒的压力称作作“操作压操作压”。 7878层析床横截面所允许的最大压力 7979三、凝胶层析操作三、凝胶层析操作 （一）样品和加样（一）样品和加样 蛋白质类样品浓度蛋白质类样品浓度: :不大不大于于4%4%。 加样时应尽量减少样品加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的的稀释，及凝胶床面的搅动。搅动。 新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用35倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。 80 由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大

38、才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样品粘度小于0.01Pas（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。分析用量一般为每100mL床体积加样品12mL，制备用量一般为每100 mL床体积加样品2030 mL，这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积，获得较满意的分离效果。81 样品黏度对洗脱曲线的影响（1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2; （3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%.

39、82 样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费，降低工作效率，还会造成样品稀释。 样品上柱是凝胶层析中最关键的一步。理想的样品色带应是狭窄且平直的巨型色谱带。为了做到这一点，应尽量减少加样时样品的稀释以及样品的非平流流经凝胶层析床体。反之将造成色谱带扩散、紊乱，严重影响分离效果。 83 加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。这一点在分级分离时尤为重要，应严格按一定的操作程序进行，通常有下列三种方法： 841 1直接将样品加到层析床表面；直接将样品加到层析床表面； 2 2利用两种液体比重不同而分层的原理，利用两种液体比重不同而分层的原理，将高比重样品加

40、入床表面低比重的洗脱液之中，样品就慢慢均匀地下沉于床表面，再打开出口，使样品渗入层析；3.3.可用微量泵控制。可用微量泵控制。 8585 （二）洗脱与收集（二）洗脱与收集 1、洗脱剂。、洗脱剂。 2、流速（流速（操作压、型号、操作压、型号、粒度）。粒度）。 3、分部收集器。分部收集器。86 为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜过快且要稳定。冼脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的涨缩引起柱床体积变化或流速改变。在许多情况下可以用水作洗脱剂，但为了防止非特异吸附，避免一些蛋白质在纯水中难以溶解（析出沉淀），以及蛋白质稳定

41、性等问题的发生，常采用缓冲盐溶液进行洗脱。 87离子浓度至少0.02mol/L方可获得较好的结果，因为凝胶含有少量羧基，会吸附少量阳离子而排斥少量阴离子。洗脱用盐等介质应比较容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸铵等易发挥的物质用得较多。对一些吸附较强的物质也可采用水和有机溶剂（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物进行洗脱。88（三）凝胶的再生和保养（三）凝胶的再生和保养 在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再生处理。但多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形成新的柱床

42、，这样流速会有所改善。89 葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用，但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为防止细菌生长和发酵，可用0.020.02叠氮化钠、叠氮化钠、0.05%0.05%三氯叔丁醇（仅在弱三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其他离子交换剂）或酸有效，也适用于其他离子交换剂）或0.0020.002洗必泰、洗必泰、0.010.01醋酸苯汞（在弱碱中有效，也适醋酸苯汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂）以及用于其他阴离子交换剂）以及0.1mol0.1molL L氢氧化氢氧化钠

43、溶液等作防腐剂钠溶液等作防腐剂。层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。 9090四、主要参数测算四、主要参数测算V V0 0及及V Vi i的测算的测算K Kd d及及K Kavav的值的值 分辨率分辨率R R9191（一）（一）V0及及Vi的测算的测算 1重量法重量法 Vt=Vo+Vi+Vg =/4d2h Vi=gWr Vo=Vt（Vi+Vg） Vg估算为估算为1cm3/g干胶。干胶。 2过柱法过柱法 已知物质的洗脱体积已知物质的洗脱体积 Ve=Vo+KdVi 如用全渗入（如用全渗入（Kd=1）或全排阻（）或全排阻（Kd=0）的物质过柱，）的物质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的测量其洗脱体积

44、，计算该凝胶柱的V0值及值及Vi值。值。 常用蓝色葡聚糖（常用蓝色葡聚糖（Kd=0）及重铬酸钾（）及重铬酸钾（Kd=1）。）。9292（二）分配系数测定（二）分配系数测定 分配系数分配系数 当测得某物质的当测得某物质的Ve及及Vt ，内水体积，内水体积Vi及及外水体积外水体积V0时，算出时，算出Kd及及Kav的值。的值。 Kd及及Kav Ve被认为是一种组分对于某一个被认为是一种组分对于某一个凝胶柱的特征常数。凝胶柱的特征常数。93（三）分辨率（三）分辨率 凝胶层析中，两物质（凝胶层析中，两物质（A和和B）和）和分辨率（分辨率（R）定义为：）定义为： 当当R值值1，两物质完全分开，小，两物质完

45、全分开，小于于1时则不能完全分离。时则不能完全分离。 分离时分离时较大柱床体积较大柱床体积可增大可增大Ve 。 减少（减少（WA+WB）的方法是）的方法是适当浓适当浓缩样品、选用小粒度凝胶、流速适缩样品、选用小粒度凝胶、流速适当减慢当减慢等。等。9494五、凝胶层析的扩展 （一）上行凝胶层析（一）上行凝胶层析 利用流动和重力方向相反的上行层析利用流动和重力方向相反的上行层析法，即法，即洗脱液向上流动洗脱液向上流动的层析法。的层析法。 反转柱反转柱 （二）增加有效床高（二）增加有效床高 -提高分辨率提高分辨率 （1）串联层析）串联层析 ：有效柱长有效柱长 （2）循环层析：即在同一根或两根）循环层析：即在同一根或两根柱上，样品反复进行层析。柱上，样品反复进行层析。9595循环层析循环层析图7.21 人血浆蓝蛋白的循环层析分离柱：交联葡聚糖凝胶G-100，3.293cm；样品：5.2ml（3%）；流速：20ml/h；洗脱液：0.1mol/L pH8.0 Tris缓冲液（含0.5mol/L NaCl） 简单的循环层析装置选择阀用于选择待循环液或废液，样品从AD上柱，经BD洗脱，经检出的废液由EC排出，需循环的物质由ED进入层析柱。 9696（三）薄层凝胶层析（三）薄层凝胶层析 用交联葡聚糖作为