甲型肝炎病毒IgM检测ELISA法作业指导书

1、甲型肝炎病毒 IgM 检测 ELISA 法 作业指导书 原理本法是用抗人 卩链捕获待测血清中特异性IgM ,然后用HAV 与特异性 IgM 抗体反应， 再加酶标记抗 M 抗体， 最后加底 物显色。标本采集采集前病人准备：受检者应空腹。标本种类：血清或血浆。标本要求：采集病人静脉血2ml （可用EDTA抗凝），室温放置不超过 4 小时，分离血清备用。标本储存： 2-8°C 保存不应超过 1周， -20°C 不应超过 3个月， -70 °C 长期保存，应避免反复冻融。标本运输：密封，室温运输。 标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不 宜作此项检测。试剂6

2、.1 试剂名称：抗 HAVIgM 检测 ELISA 试剂盒6.2 试剂生产厂家：郑州博赛生物技术研究所6.3 包装规格： 48Test/Kit6.4 试剂盒组成： 包被反应板，样品稀释液，酶标记抗体，阳性对照血清，阴 性对照血清，浓缩洗涤液，底物 A，底物B,终止液，封口膜，密封袋。 6.5 试剂储存条件及有效期： 2-8°C 避光保存， 有效期 6 个月。仪器设备 仪器名称：自动酶标仪 仪器厂家： KHB 仪器型号： ST360 操作步骤平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25 C）,微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。配液： 浓缩洗涤液配制前充分摇匀 （如有晶体应充分溶解

3、） ， 浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按 1 ： 19 稀释后使用。编号：将微孔条固定于支架，按序编号。 加样品稀释液：用加样器在微孔反应条板孔中加入样品稀 释液，每孔 100（l ，空下四孔准备加对照。加标本和留空白： 将每份待检标本各 5（l 分别加入已有样品 稀释液的各孔中， 留下一孔不加标本作空白对照， 标好位置。加对照：在预先空下的四孔中用加样器分别加入阴性对照一孔，阳性对照三孔，每孔 100（1，标好位置。对照应在所有 标本加完以后再加，以保证阈值准确性。温育（一）：充分混匀，加上封板膜，置 37C温育20分钟。 洗涤（一） ：用洗涤液充分洗涤 5 次，洗涤完扣干（每次应 保持 30

4、-60 秒的浸泡时间） 。加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体100（l ，轻拍混匀。8.10温育（二）：充分混匀，加上封板膜，置37 C温育30分钟。8.11 洗涤（二）：用洗涤液充分洗涤 5 次，洗涤完扣干（每 次应保持 30-60 秒的浸泡时间） 。8.12显色：每孔加入底物 A、B各50（1，轻拍混匀，置37C暗处 10 分钟。8.13终止：每孔加终止液 50（1，混匀。8.14 测定：用酶标仪单波长 450nm 或双波长 450/630nm 测 定各孔 OD 值（用单波长测定时需设空白对照一孔， 30 分钟 内完成测定，并记录结果） 。9. 结果判断与分析9.1临界值（C.O.）的计算：

5、临界值=阴性对照孔OD值NX2.1,阴性对照OD均值大于0.1时应重新试验，小于0.05 时以 0.05 计算。9.2 结果判定：样品 OD 值 S/C.O>=1 者为阳性样品 OD 值 S/C.O<1 者为阴性10. 质量控制：每次均应有阴阳对照，其 OD 值应在要求范 围内。参考值范围：阴性12. 临床意义： 血清中抗 HA V-IgM 在亚临床期即已出现， 其 滴度在感染后 3 个月维持在 1000 以上，已被公认为早期诊 断甲型肝炎的依据。13. 操作性能：特异性强，灵敏度高，重复性好。14. 方法局限性15. 注意事项15.1 每 板 建 议 设 阴 阳 性 对 照 血

6、清 各 两 孔 ，设 空 白 对 照 时，不加样品及酶标记抗体，其余各步相同。15.2 洗 涤 时 各 孔 均 须 加 满 ，防 止 孔 口 内 有 游 离 酶 未 能 洗净。15.3 加 试 剂 前 应 将 试 剂 瓶 翻 转 数 次 ，使 液 体 混 匀 。如 果 滴 加 ， 滴 加 前 应 弃 去 1-2 滴 。 滴 加 时 瓶 身 应 保 持 垂 直，以使滴量准确。注意勿将试剂滴在孔壁上。15.4 所 有 样 品 都 应 按 传 染 源 处 理 。15.5 封 口 膜 使 用 说 明15.5.1 微 孔 板 拆 封 后 ， 在 取 出 当 天 所 需 的 微 孔 条 后 ， 其余微孔条可以封口膜封存以避免受潮。在封存时， 注意勿把封口膜粘贴到微孔条底部，以免影响其透光 性。15.5.2 微 孔 板 温 育 时 ，以 封口 膜 覆 盖 孔 口 ，可 避 免 其 他因素对实验带来的非预期的影响。15.6 不 同 品 名 、不 同 批 号 的试 剂 不 可 混 用 ，以 免 产 生 错误结果。16. 当检测系统（ 仪器）不 能工作时，所 采取的补救 措施：应保证所有操作步骤正确无误；可以比对阴阳 对照，肉眼判读；无法准确判读者，应留样待系统正 常后复查。17. 参考文献 ：中华人民共和国卫生部