细胞培养入门技术学习教案

1、会计学1第一页，共46页。第1页/共46页第二页，共46页。离心机橱柜(chgu)实验台冰箱(bngxing)培养箱试剂(shj)柜实验仪器台超净工作台实验台实验台实验台实验台水池冰箱衣柜实验台显微镜递物窗缓冲间无菌操作室准备室1.细胞培养室设置第2页/共46页第三页，共46页。下风口下风口(fngku)上风口上风口(fngku)无菌操作室第3页/共46页第四页，共46页。超净工作台和CO2培养箱2.2.细胞培养的主要细胞培养的主要(zhyo)(zhyo)实实验设备验设备n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作

2、台内构成无菌环境。 nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒箱内蒸馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。第4页/共46页第五页，共46页。解剖(jipu)显微镜倒置(dozh)显微镜2.2.细胞培养的主要实验细胞培养的主要实验(shyn)(shyn)设备设备第5页/共46页第六页，共46页。血清（天然(tinrn)成分）：基础(jch)培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM 、-MEM、RPMI1640水：高纯度的去离子水细胞培养的主要(zhyo)试剂（

3、培养基）抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/mln 血清质量好坏是实验成败的关键。n 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污染。n 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟n 血清的消毒：过滤除菌n 血清的使用浓度为520消化液：常用0.25胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁， 用含血清培养液中止其活性第6页/共46页第七页，共46页。细胞培养用器皿(qmn)的清洗和消毒 一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤(bzhu)：1、自来水浸泡2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超

4、声处理）3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水）4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用 常用消毒方法：1、湿热灭菌法（高压(goy)蒸汽灭菌），15磅，1520min2、过滤除菌(如：血清的除菌）第7页/共46页第八页，共46页。 细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来，置于培养皿中，并在一个合适的环境(hunjng)中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的方法。第8页/共46页第九页，共46页。 原代培养(primary culture)，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次(shu c)培养

5、，中途不分割培养物。常用的原代培养方法有组织块培养法和消化培养法。第9页/共46页第十页，共46页。 传代培养(secondly culture)，在原代培养物铺展(pzhn)为单细胞层后，将原代培养细胞分开接种到两个或多个新的培养瓶中继续培养增殖。第10页/共46页第十一页，共46页。第11页/共46页第十二页，共46页。v 贴附型v 成纤维样细胞(xbo)型v 上皮样细胞(xbo)型v 悬浮型培养人真皮成纤维细胞培养人口腔上皮细胞培养的骨髓瘤细胞第12页/共46页第十三页，共46页。v 细胞(xbo)的贴壁生长v 接触抑制v 细胞(xbo)的生长曲线细胞细胞(xbo)(xbo)贴壁延展过程

6、贴壁延展过程( (模式图模式图) )细胞的接触抑制现象细胞的接触抑制现象第13页/共46页第十四页，共46页。正常正常(zhngchng)培养细胞的培养细胞的生长曲线生长曲线退化(tuhu)死亡平台(pngti)期细胞数增大极限点，出现接触抑制细胞指数生长极限点指数生长期潜伏期细胞数量024487296120小时指数生长期是最佳实验期指数生长期是最佳实验期 ! !第14页/共46页第十五页，共46页。第15页/共46页第十六页，共46页。 KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20加水至1000 ml第16页/共46页第十七页，共46页。n胰蛋白酶是一种黄

7、白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。n用含血清培养液终止其对细胞的消化作用第17页/共46页第十八页，共46页。第18页/共46页第十九页，共46页。第19页/共46页第二十页，共46页。第20页/共46页第二十一页，共46页。第21页/共46页第二十二页，共46页。第22页/共46页第二十三页，共46页。第23页/共46页第二十四页，共46页。第24页/共46页第二十五页，共46页。第25页/共46页第二十六页，共46页。第26页/共46页第二十七页，共46页。v 将原代培养物分割后重新接种到

8、两个或多个培养瓶内进行培养，这一操作称为传代培养,传代比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异.v 细胞传代培养的意义(yy)v 传代时机的把握v 传代培养的代数限制；少数细胞可出现永生化第27页/共46页第二十八页，共46页。吸去旧液加入加入(jir)消化液消化液解离细胞约解离细胞约2min在倒置(dozh)显微镜下观察，细胞呈圆粒状细胞细胞(xbo)的传代培养：贴附的传代培养：贴附型型PBS洗 涤12次吹打悬浮细胞调整细胞密度 分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察第28页/共46页第二十九页，共46页。细胞细胞(xbo)的传代培养：贴附的传代培养：

9、贴附型型培养细胞(xbo)的观察培养液颜色培养液颜色(yns)、是否清亮、是否清亮培养细胞的状态培养细胞的状态第29页/共46页第三十页，共46页。细胞细胞(xbo)的传代培养：贴附型的传代培养：贴附型吸去旧液加入加入(jir)消化液消化液解离细胞约解离细胞约5min在倒置(dozh)显微镜下观察，细胞呈圆粒状PBS洗 涤12次吹打悬浮细胞调整细胞密度 分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察胰酶消化数分钟胰酶消化数分钟细胞脱离器壁，呈圆粒状细胞脱离器壁，呈圆粒状第30页/共46页第三十一页，共46页。吸去旧液加入加入(jir)消化液消化液解离细胞约解离

10、细胞约2min在倒置(dozh)显微镜下观察，细胞呈圆粒状细胞细胞(xbo)的传代培养：贴附的传代培养：贴附型型PBS洗 涤12次吹打悬浮细胞调整细胞密度 分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察中止消化、吹散细胞中止消化、吹散细胞细胞计数，调节密度细胞计数，调节密度第31页/共46页第三十二页，共46页。细胞细胞(xbo)的传代培养：悬浮的传代培养：悬浮型型直立瓶去旧液加新液分瓶接种加新液第32页/共46页第三十三页，共46页。第33页/共46页第三十四页，共46页。第34页/共46页第三十五页，共46页。第35页/共46页第三十六页，共46页。第36页/共46页第三十七页，共46页。第37页/共46页第三十八页，共46页。