人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定

1、人smad3的shrna表达载体构建和鉴定作者：谢桥生雷小英王立锋 孟艳玲王芳薛茜温伟红杨安钢【摘要】 目的：构建人smad3的shrna表达载体，运用rnai下调smad3 基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响方法：化学 合成针对人smad3基因的dsrna,瞬时转染入hela细胞，检测rma干扰效 果，筛选冇效干扰靶位点；设计并合成针对人smeicl3基因的sirna寡核昔 酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体psilencertm3. 1 hl hygro, 转染入hela细胞，jj hygromycin b筛选稳定单克隆细胞株，对细胞株行 rt pcr和western b

2、lot检测，观察sirna对靶基因的抑制效果，进一 步研究下调fi的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化.结果：瞬时转 染筛选到了冇效的rna干扰靶位点，构建载体后，建立稳定转染的单克隆 细胞株,smad3 mrna和蛋白质水平均显著下调，导致肿瘤细胞生长抑制.结 论：成功构建了针对人smad3高效、特异、作用持久的shrna表达载体, 转染细胞后可下调smad3的表达，为进一步研究smad3的功能和肿瘤的基 因治疗奠定了基础.【关键词】smad3； rna干扰；遗传载体；肿瘤生长抑制0引言smad家族成员是tgf b信号通路中的重要分子，根据其结构和功能 的相似性，可分为三个亚家族，即rsma

3、dscreceptor regulated smads),cosmadsccommon smads),和 i smads( inhibitory smads) 1 smad3 是r smads中的一个成员，参与细胞增殖、分化、细胞外基质调节、肿 瘤细胞迁移，与其功能相近的还有smad2, smadl, smad5, smad8.近年来, smads信号通路在肿瘤细胞屮的作用逐渐引起人们的关注，有望成为肿瘤 治疗中的潜在有效靶点2-5我们通过瞬时转染dsrna （double stranded rna,双链 rna）入 hela 细胞，筛选有效的 sirna （small interferenc

4、e rna）序列，并构建 shrna （small hairpin rna）表达载体, 建立持续低表达smad3的稳定细胞株，以期进一步探求smad3下调后对肿 瘤牛物学性状的影响.1材料和方法1. 1材料质粒载体ps订encertm3. 1 hl hygro山西京医院刘家云博 士惠赠；大肠杆菌dii 5a、宫颈癌细胞系ilela由本实验室保存；细胞 培养试剂、trizol reagent rt pcr 试剂盒、hygromycin b, lipofectaminetm 2000 （ invitrogen 公司）；牛血清白蛋白（bsa） 兔抗 人antismad3多克隆抗体（sc 8332,

5、santa cruz公司）；兔抗人且ntiactin多克隆抗体、hrp标记羊抗兔二抗（武汉博士德公司）；nc膜 （millipore公司）；bca法蛋白定量试剂盒 western blot发光液（pierce 公司）；各种限制性核酸内切酶、t4 dna连接酶（takara公司）；小量质 粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒屮提试剂盒（promega公司）western blot设备（bio rad公司）；凝胶成像仪（ultra violet公司）；高速 离心机（beckman公司）;紫外分光光度计（ultrospec 2000, pharmacia biotech公司）；pcr仪（ptc 200,

6、 mj research公司）；酶联免疫检测仪(model 500, bio rad 公司).12方法1. 2. 1 sirna的设计根据rna干扰靶位点的设计原则，从smad3 mrna(nm_005902)的编码序列屮寻找符合设计特征的靶位点，经blast软件 进行同源分析证实为smad3特异性序列后，选择其编码区第941-959位 核昔酸为干扰靶位点，山上海吉玛公司合成其dsrna序列，smad3正义链: 5 ' gcacauaauaacuuggaccdtdt 3 ', 反 义链：5 ' cguguauuauugaaccuggdtdt 3由公司提供的阴性对照dsr

7、na与人类 基因无同源性，正义链：5 uucuccgaacgugucacgudtdt 3，,反义链: 5' aagaggcuugcacagugcadtdt 3' 1. 2. 2shrna表达质粒载体的构建按上述靶位点构建shrna表达载体， 根据psilencertm3. 1 iii hygro质粒载体的要求设计1对能编码shrna 的寡核昔酸链，正义链：5 gatccgcacataataacttggaccttcaagagaggtccaagttattatgtgcttttttggaaa3', 反义链： 5'agcttttccaaaaaagcacataataactt

8、ggacctctcttgaaggtccaagttattatgtgcg 3 ；序列两端包含bamh i和hindhi两个酶切位点， 交由上海生工合成.阴性对照质粒为公司提供的针対绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, gfp)的干扰载体，正义链：5 r gatccggttatgtacaggaacgcattcaagagatgcgttcctgtacat aaccttttttggaaa 3 ,反义链：5 agctttttccaaaaaggttatgtacaggaacgcatctcttgaatgcgttcctgtacataaccg 3取寡核廿酸链制备退火双链dna,连接入 经

9、 bamll i 和 ilindlll双酶切的 psilencertm3. 1 iii hygro 载体,将连接 产物转化dh 5 a感受态细胞，在氨节青霉素阳性琼脂板上长出菌落，挑 取单个菌落送交北京奥科生物公司测序.1.2.3细胞转染及单克隆细胞株的筛选常规培养hela细胞于含100 ml/l胎牛血清的rmpi 1640, 50 ml/l c02中，瞬时转染前24 h,接种细 胞于6孔板中（2x105/孔），按lipofectaminetm2000操作说明转染hela 细胞.稳定转染筛选单克隆细胞株时，于转染前24 h接种细胞于6孔板 中（5x105/孔），转染后细胞培养于含100 ml/

10、l胎牛血清的rmpi 1640, 50 ml/l c02, 150 mg/l hygromycin b中，2 wk左右长出单个细胞克隆 集落，用胰酶消化，用有限稀释法再一次筛选岀单克隆细胞株，在 hygromycin b筛选压力下，经历3 wk扩大培养后，得到持续低表达smad3 的单克隆细胞株.1. 2. 4rtpcr检测基因mrna表达水平在6孔板屮，每孔加入triz0lreagent 1 ml提取细胞总rna,操作按试剂说明书进行，经逆转录得 到cdna.用专业软件设计引物，内参照b actin上游引物：5 tgcgcagaaaacaagatgagatt3 7； 下游 引物：5 ztgg

11、gggacaaaaagggggaagg 3 ' smad2 上游引物：5 ' ttccgcctctggatgacta 3 ；下游引物：5 tttctaccgtggcatttcg 3 smad3 ±游引物：5 cacgcagaacgtcaacac 3 ；下游引物：5gtgaagccatccacagtc3'1. 2. 5western blot检测基因蛋白质表达水平加入细胞裂解液ripa,提取细胞总蛋白，用蛋白定量试剂盒检测细胞裂解液蛋白浓度后，行sdspage,每孔加样100 ug,转膜,用50g/lbsa封闭过夜，一抗4°c孵 育12 h,二抗室温孵

12、育2 h,化学发光按操作说明进行，英中anti smad3 按1 ： 200稀释，anti actin按1 : 400稀释，二抗按1 : 2000稀释.1. 2. 6mtt法检测hela细胞的增殖将稳定建株的hela细胞接种于96 孔板中（2x103/孔），每孔加入5 g/l mtt溶液20 ul ,继续培养4 h , 终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 u l dmso ,振荡10 min ,使紫色结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔a490 nm, 以时间为横轴，a490 rnn为纵轴绘制细胞生长曲线.2结果2. 1瞬时转染dsrna后细胞内smad3的表达以bacti

13、n和actin作为内参照，实验组较对照组的smad3 mrna和蛋白质水平均下降（图1）2. 2shrna表达质粒载体的鉴定测序结果表明载体构建成功（图2）2. 3稳泄建株细胞内smad3的表达转染shrna组与阴性对照组相比， smad3 mrna和蛋白质水平均下降，smad2水平没有变化，与瞬时转染的结 果相一致（图3）ec：实验对照，有脂质体，无dsrna； nc：阴性对照；rnai：转染dsrna 组.2. 4hela细胞的增殖持续低衣达smad3的实验组与阴性对照组相比， 细胞生长受抑制（图4）.图4hela细胞生长曲线3讨论rna干扰（rna interference, rnai）

14、是双链rna介导的、序列特异的 转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing, ptgs)现象，广 泛存在于线虫、果蝇、植物、真菌及哺乳动物等多种生物体中，具有特异 性和高效性，被广泛用于基因功能鉴定和基因治疗研究6经过化学修饰的dsrna分子质量小，瞬时转染入细胞中，作用效 果显著，但是其效果与细胞转染效率密切相关，且作用不持久，只能反映 暂时的基因表达下调7-8构建质粒载体，建立稳定单克隆细胞株， 在宿主细胞内持久产生shrna,发挥rna干扰效应9,能长时间降低目 的蛋白在细胞内的表达，进而研究宿主细胞一系列细胞牛物学行为，以及 目的蛋白上下游分子

15、的变化.我们运用了 dsrna筛选有效干扰靶位点速度 快的特点，筛选到有效的就序列，再结合稳定转染建株的优势，实现了 对smad3分子高效、持久的下调表达.在图1和图3中，因为smad2和sinad3 功能相近，同源性高，检测它没有发生变化，说明针对h的分子smad3的 rna干扰是特异的.smad家族分子，很久以来被认为是肿瘤抑制基因10,随着研 究的深入，发现其作用是双重的，smad3作为tgf b信号通路中的重要 分子，因为作用广泛而备受重视.在肿瘤进展中，它的活化调节一系列与 肿瘤进展相关基因的转录，引起肿瘤细胞迁移能力增强，恶性程度增加， 这些都与肿瘤患者的预后密切相关；然而它发挥作

16、用冇组织来源差异性， 不同来源的肿瘤细胞中，有着截然相反的效应，这是因为调节基因转录时, 还要和核内其他转录因子以形成复合物的方式与顺式作用元件相结合，这 是个复杂的过程，探索这些现象，对于肿瘤基因治疗有指导意义2-3, 5, 11我们观察到，在稳定建株的细胞中smad3持久低水平表达，ilela 细胞生长受抑制，进一步探索其中的分子机制，研究肿瘤生物学行为的变 化，对于肿瘤基因治疗冇重要意义.【参考文献】1 liliana a, lee il the smads j genome biol, 2001, 2(8) : r3010.2 amelia sc dual role for tgf b

17、l in apoptosis j . cytok ino growth factor rev, 2005,16:15-34.3 jonathan ml, shoukat d, raghu k, et al. the epithelial mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease j j cell biol, 2006, 172 (7) :973-9814 aristidis m, carl hh. non smad tgf b signals j . j cell sci, 2005,

18、 118:3573-3584.5 anita br, fang t, stacey db, et al. smad3 is key to tgfp mediated epithelial to mesenchymal transition, fibrosis, tumor suppression and metastasis j . cytokine growth factor rev, 2006,17:19-27.6 novina cd, sharp pa. the rnai revolutio n j nature, 2004, 430:161-164.7 elbashir sm, harborth j,