圆盘电泳按改进版ppt课件

1、特别提示特别提示 样品浓度及加样关系样品浓度及加样关系 样品来源：样品来源：说是最纯的样品，实践并不纯，正好做电泳说是最纯的样品，实践并不纯，正好做电泳 沃宏沃宏Wo Hong 738328 10g LOT2021/04 样品称号：样品称号： 牛血洁白蛋白牛血洁白蛋白 BSA Albumin Bovine; from bovine serum; Mr:68000 样品配制：样品配制： 1.0mg/ml; 加样体积：加样体积： 20.0ul ，也可以，但色带，也可以，但色带较宽能够较宽能够 与加样体积过大有关，另外三条色带其中一条与加样体积过大有关，另外三条色带其中一条较淡，有的较淡，有的 当时

2、难识别，不是很清楚，或有或无的觉得。当时难识别，不是很清楚，或有或无的觉得。 建建 议：议： 4.0mg/ml; 加样体积：加样体积： 10.0ul 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 1、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳是以丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺，在催剂的作用下聚合而成的具有三维网壮构造的大分子凝胶作为支持介质的一种区带电泳。在这种电泳中由于采用了凝胶孔径，pH值，缓冲液成分和电位梯度的不延续系统，因此它具有高分辨率的三种效应，即：浓缩效应，分子筛效应和电荷效应。在凝胶中当对被分析的样品进展这种电泳时，样品中的各成分首先经过浓缩，然后再根据他们各自所带电荷，分子量的大小以及外形的

3、差别，以不同的迁移率电泳分别而成带。 因本实验是采用聚丙烯酰胺凝胶在垂直的小玻管中进展的，经电泳后分别的样品带形似圆盘，因此称之为垂直管型聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳简称圆盘电泳。2 2、目的与要求、目的与要求 用圆盘电泳的方法分别蛋白质样品，经用圆盘电泳的方法分别蛋白质样品，经过实验了解和熟习运用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳过实验了解和熟习运用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳进展分析的方法和实验过程。进展分析的方法和实验过程。3 3、仪器、器材与安装、仪器、器材与安装 ： 3-13-1、实验仪器：、实验仪器：1 1、 电电 泳泳 仪：仪： (a)(a)：EPS604EPS604稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 ( (

4、南京科保仪器研讨所南京科保仪器研讨所) ) (b) (b)：DYY-6CDYY-6C和和DYY-7CDYY-7C型电泳仪型电泳仪 ( (北京市六一仪器厂北京市六一仪器厂) ) (c) (c)：DYY-6BDYY-6B稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 ( (南京大学储平厂南京大学储平厂2 2、 圆盘电泳槽安装一套圆盘电泳槽安装一套 ( (南京大学储平厂南京大学储平厂 规格：规格：1212根玻管和根玻管和6 6根玻管两种；根玻管两种； 3 3、 磁力搅拌器磁力搅拌器 ( (上海沪西分析仪器厂上海沪西分析仪器厂 ) ) 90-1 90-1型恒温磁力搅拌器型恒温磁力搅拌器 4 4、 混混 合合 器器 (

5、(上海沪西分析仪器厂上海沪西分析仪器厂) ) WH-3 WH-3微型旋蜗混合仪微型旋蜗混合仪5 5、 天天 平平 a a：BL-2200H,BL-2200H,电子天平，最大称量电子天平，最大称量22002200克，感量：克，感量：0.01g0.01g SHIMADZU CORPORATION SHIMADZU CORPORATION b b：BS110S, BS110S, 电子天平，最大称量电子天平，最大称量110110克，感量：克，感量：0.1mg0.1mg Sartorius Sartorius北京赛多利斯天平北京赛多利斯天平3-23-2、实验器材：、实验器材：1、 可调自动取液器： a：

6、微量取液器10ul，20 ull b：常量取液器1000ul2、 微量注射器：5ul ；10ul； 25ul3、 医用注射器：10毫升或5 毫升二种4、 8#针头5、 有机玻璃凝胶小玻管架：(12孔 / 2排)6、 小玻管：长：10cm，内直径：0.4cm和0.5cm 7、 量 筒：250毫升， 100毫升 和10毫升 8、 烧 杯 9、 试 管 10、 试管架 11、 洗耳球12、 玻 棒13、 剪 刀14、 胶布条15、 吸水纸 图图1、圆盘电泳槽安装图、圆盘电泳槽安装图4、试剂与配制：4-1、实验试剂：、实验试剂：1、 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺 Acr 2、 甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺

7、Bis3、 过过 硫硫 酸酸 铵铵 AP4、 四四 甲基甲基 乙二胺乙二胺 TEMED5、 三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷 Tris6、 鸡蛋白蛋白测试品鸡蛋白蛋白测试品 CEA 7、 考马斯亮兰考马斯亮兰G-25 8、 三氯醋酸三氯醋酸 TCA9、 甘氨酸甘氨酸 gly10、溴酚兰、溴酚兰11、蔗、蔗 糖糖 12、盐、盐 酸酸4-24-2、试剂的配制：、试剂的配制：1 1、蔗糖溶液、蔗糖溶液( (测试品溶解液测试品溶解液) )的配制的配制: : 称取蔗糖称取蔗糖2.0 g2.0 g，加蒸馏水，加蒸馏水10.0 ml10.0 ml200 mg/ml200 mg/ml溶解混匀即可。溶解混匀即可

8、。 也可用也可用5-15-12 2步骤中步骤中“G G溶液溶液400 mg/ml400 mg/ml来配制测试品来配制测试品2 2、1%1%的溴酚兰溶液的配制：的溴酚兰溶液的配制： 称取称取1.0g1.0g溴酚兰，加溴酚兰，加100.0ml100.0ml蒸馏水，溶解混匀即可。蒸馏水，溶解混匀即可。3 3、测试蛋白质样品溶液、测试蛋白质样品溶液(1.0mg/ml)(1.0mg/ml)的配制：的配制： 称取称取CEACEA样品样品1.0 mg1.0 mg于小塑料离心管内，加蔗糖溶液于小塑料离心管内，加蔗糖溶液1.0 ml1.0 ml和溴酚兰溶液和溴酚兰溶液4-6 4-6 滴，溶解后放在冰箱中备用无须

9、加热。滴，溶解后放在冰箱中备用无须加热。4 4、10%10%的考马斯亮兰溶液的配制：的考马斯亮兰溶液的配制： 称取称取1.0g1.0g考马斯亮兰考马斯亮兰G-250G-250，加，加10.0ml10.0ml蒸馏水溶解混匀即可。蒸馏水溶解混匀即可。5 5、染色固定液的配制：、染色固定液的配制： 称取三氯醋酸称取三氯醋酸15.0g15.0g，加蒸馏水，加蒸馏水100.0 ml100.0 ml200 mg/ml200 mg/ml，再加，再加10%10%考马斯亮兰考马斯亮兰 G250 G250溶液溶液0.5ml0.5ml也可根据实践效果添加或减少溶解混匀即可。也可根据实践效果添加或减少溶解混匀即可。5

10、 5、四甲基乙二胺、四甲基乙二胺TEMEDTEMED溶液的配制：溶液的配制： 该试剂为液体溶液，直接取原液，无须配制。该试剂为液体溶液，直接取原液，无须配制。6 6、1.0 mol/L HCL1.0 mol/L HCL溶液的配制：溶液的配制： 取取1.0 ml 1.0 ml 浓浓HCLHCL浓浓HCL-12 NHCL-12 N，加，加11.0ml11.0ml蒸馏水混匀即可。蒸馏水混匀即可。7 7、电极、电极BufferBuffer的配制：的配制： 分别称取分别称取TrisTris：0.6g 0.6g ， Gly Gly：2.88g2.88g于烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，然后用于烧杯中，先用少量

11、蒸馏水溶解，然后用 蒸馏水定容至蒸馏水定容至500500毫升混匀毫升混匀pH8.3pH8.3即可。即可。5 5、凝胶的聚合、凝胶的聚合 5-1 5-1、凝胶贮液的配制：、凝胶贮液的配制： 1 1、分别胶、分别胶7.5%7.5%贮液的配制：贮液的配制： A A：称取：称取Tris. 3.7 gTris. 3.7 g；加；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml1.0 mol/L HCL 4.8 ml；最后加蒸馏水至最后加蒸馏水至 10ml10ml，pH8.9pH8.9即可。即可。 B B：分别称取：分别称取Acr 3.0 gAcr 3.0 g；Bis 0.08 gBis 0.08 g；加蒸馏水

12、至；加蒸馏水至10. 0 ml10. 0 ml溶解混匀即可。溶解混匀即可。 C C：称取过硫酸铵：称取过硫酸铵(AP) 0.028 g(AP) 0.028 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10. 0 10. 0 mlml溶解、混匀即可。溶解、混匀即可。 D D：蒸馏水：蒸馏水 分别取：分别取：A A ：B B ：C C ：D = 1.0ml D = 1.0ml ：2.0ml 2.0ml ：4.0ml 4.0ml ：1.0ml 1.0ml 8.0 ml8.0 ml 按上述比例加完后，再另外单独加按上述比例加完后，再另外单独加 TEMED TEMED 20 -25ul20 -25ul2 2、浓缩胶、浓缩

13、胶2.5%2.5%贮液的配制：贮液的配制： E E： 称取称取Tris. 0.598 gTris. 0.598 g；加；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml1.0 mol/L HCL 4.8 ml；最后加蒸馏水；最后加蒸馏水10ml,10ml, pH6.9 pH6.9即可。即可。 F F： 分别称取分别称取Acr 1.0 gAcr 1.0 g；Bis 0.25 gBis 0.25 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10. 0 ml10. 0 ml溶解、混匀即可。溶解、混匀即可。 G G： 称取蔗糖称取蔗糖4.0 g4.0 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10. 0 ml10. 0 ml溶解、混匀即可。

14、溶解、混匀即可。 H H： 称取过硫酸铵称取过硫酸铵(AP) 0.028 g(AP) 0.028 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10. 0 ml10. 0 ml溶解混匀即可。溶解混匀即可。 分别取：分别取：E E ：F F ：G G ：H = 0.5 ml H = 0.5 ml ：1.0 ml 1.0 ml ：0.5ml 0.5ml ：2.0ml 2.0ml 4.0 ml4.0 ml 按上述比例加完后，再另外单独加按上述比例加完后，再另外单独加TEMED 30-40 ulTEMED 30-40 ul5-35-3、分别胶的制备：、分别胶的制备： 1、将清洁、无破碎枯燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝下

15、垂直放入有机玻璃 凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.5 cm处作一记号。 2、用自动取液器1000 ul或注射器汲取上述配好的分别凝胶贮液 沿着小玻管内壁小心准确参与7.5 cm高。 3、凝胶溶液加毕后，随即用自动取液器或注射器汲取蒸馏水，悄然 加至管中的凝胶外表，使其外表覆盖1.0cm 高水层。在灌胶和封水 的过程中，操作要轻，以防止产生气泡。 4、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进展聚合反响，在正常情况下大约40分钟 后，待界面出现明显分层景象时，阐明胶已聚合终了，即可加浓缩胶。 5-45-4、浓缩胶的制备：、浓缩胶的制备：1 1、悄然倒掉分别胶玻管上端的蒸馏水，并用吸水纸吸去未倒净、悄然

16、倒掉分别胶玻管上端的蒸馏水，并用吸水纸吸去未倒净 的蒸馏水但不能触及胶面然后再小心参与该浓缩胶贮液至的蒸馏水但不能触及胶面然后再小心参与该浓缩胶贮液至 1.0cm1.0cm高。高。2 2、随后同样加、随后同样加1.0cm1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶外表。于室温下静置，高的蒸馏水层覆盖胶外表。于室温下静置， 以进展聚合反响，正常情况下大约也在以进展聚合反响，正常情况下大约也在4040分钟左右后，待浓缩分钟左右后，待浓缩 胶出现乳白色时，阐明胶已聚合终了，终了聚合，同时将每一根凝胶出现乳白色时，阐明胶已聚合终了，终了聚合，同时将每一根凝 胶玻管用吸水纸悄然吸去浓缩胶外表上的蒸馏水层，此时凝胶已制胶

17、玻管用吸水纸悄然吸去浓缩胶外表上的蒸馏水层，此时凝胶已制 备完成，即可进展点样、电泳。备完成，即可进展点样、电泳。6 6、电、电 泳：泳：6-16-1、加样：下面、加样：下面2 2种加样方法，任选其中一种种加样方法，任选其中一种 1 1、直接用、直接用20ul20ul自动取液器取自动取液器取10ul10ul测试样品溶液，悄然参测试样品溶液，悄然参与到凝胶与到凝胶 玻管上端浓缩胶外表，然后再悄然参与适量的电极玻管上端浓缩胶外表，然后再悄然参与适量的电极BufferBuffer溶液。溶液。 圆盘电泳建议用第一种加样方法圆盘电泳建议用第一种加样方法 2 2、先用注射器参与适量的电极、先用注射器参与适

18、量的电极BufferBuffer溶液到凝胶玻管上端溶液到凝胶玻管上端浓缩胶表浓缩胶表 面，然后用微量注射器取面，然后用微量注射器取10ul10ul测试样品溶液，并将微量测试样品溶液，并将微量注射器针注射器针 头经过电极头经过电极BufferBuffer溶液插入到浓缩胶外表，并悄然参与溶液插入到浓缩胶外表，并悄然参与之，参与之，参与 终了，悄然取出微量注射器此法，防止了样品的分散，终了，悄然取出微量注射器此法，防止了样品的分散，对新手对新手 特别有利即可。特别有利即可。 垂直平板电泳建议用第二种加样垂直平板电泳建议用第二种加样方法方法 6-2 6-2、安装凝胶管：、安装凝胶管： 将加好样品的凝胶

19、管加样端将加好样品的凝胶管加样端上端，分别插入到上电泳槽孔上端，分别插入到上电泳槽孔中的各乳胶管孔内，然后将已插满中的各乳胶管孔内，然后将已插满凝胶管的上电泳槽下端放入加有电凝胶管的上电泳槽下端放入加有电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可经过悄管下端管口易产生气泡，可经过悄然摆动凝胶玻管以去除气泡。插入然摆动凝胶玻管以去除气泡。插入上电泳槽的玻管上端，用注射器悄上电泳槽的玻管上端，用注射器悄然滴满电极溶液，以免产生气泡，然滴满电极溶液，以免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。最后将上电泳槽装满电极液。 6-36-3、接通电源：、接通电源： 接通

20、电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上槽电极接负极，下槽电极接正极，以稳上槽电极接负极，下槽电极接正极，以稳压压300 V 300 V 1212管开场进展电泳，直至指管开场进展电泳，直至指示剂前沿到达凝胶管底部约示剂前沿到达凝胶管底部约0.5 cm0.5 cm处，停处，停顿电泳约顿电泳约2 2小时左右。电压应由小逐渐小时左右。电压应由小逐渐加大至额定值。确定电泳终了时间，以不加大至额定值。确定电泳终了时间，以不应将考马斯亮兰跑出凝胶管为止，缘由是应将考马斯亮兰跑出凝胶管为止，缘由是防止最小分子量蛋白质跑出凝胶管。防止最小分子量蛋白质跑出凝胶管。 6-4 6-4、

21、取出玻管内的凝胶：、取出玻管内的凝胶： 预备电泳终了时，首先封锁电源。预备电泳终了时，首先封锁电源。取出小玻管，然后将一支带有取出小玻管，然后将一支带有8#8#针头的注针头的注射器吸有适量水蒸馏水或自来水，把射器吸有适量水蒸馏水或自来水，把针头渐渐插入玻管内壁和凝胶柱外表之间，针头渐渐插入玻管内壁和凝胶柱外表之间，一边开场压水，一边同时使针头渐渐贴紧一边开场压水，一边同时使针头渐渐贴紧管壁呈螺旋式前进，假设一端不行，再在管壁呈螺旋式前进，假设一端不行，再在管的另一端按同样的方法剥离，这样依托管的另一端按同样的方法剥离，这样依托水流的压力和滑润力，使玻管内壁与凝胶水流的压力和滑润力，使玻管内壁与

22、凝胶分别，最后用洗耳球在管的一端悄然挤压，分别，最后用洗耳球在管的一端悄然挤压，另一端对着一干净的试管另一端对着一干净的试管15CM15CM长内，长内，此时可以将凝胶柱压出玻管进入试管内。此时可以将凝胶柱压出玻管进入试管内。 6-5 6-5、凝胶固定与染色：、凝胶固定与染色： 在含有凝胶柱的试管内，参与在含有凝胶柱的试管内，参与适量染色液，放置染色适量染色液，放置染色3030分钟凝分钟凝胶中蛋白质区带亦被固定，终了，胶中蛋白质区带亦被固定，终了，弃去试管内的染色液，再用自来水弃去试管内的染色液，再用自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，浸泡洗试管内凝胶柱数遍，完后，浸泡在自来水中。在自来水中。 6-66-6、凝胶脱色以自来水作脱色、凝胶脱色以自来水作脱色剂：剂： 间隔一定时间后，弃去试管内间隔一定时间后，弃去试管内浸泡凝胶柱的废自来水，再用新颖浸泡凝胶柱的废自来水，再用新颖自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，再浸泡在自来水中，如此反复多次，再浸泡在自来水中，如此反复