菌种传代和保育

1、文件名菌种传代和保育编号SH-JSGC-06-008版次1.0生效日期2013-03-25页码7/7起草审核批准 广州晟和医疗科技有限公司 标准操作规程菌种传代和保育SH-JSGC-06-008起草： （叶玉虹/质检员）审核： （吴锦添/质管经理） 批准： （王明和/管理者代表）前三次修改历史：No.页次修改后版本修改日期主要修改内容DCRNo.1 目的 规范试验用菌的管理制度，保证菌种正常保存和传代。2 范围广州晟和医疗科技有限公司质量管理部使用的菌种。3 责任 QC主管、质检员。4 相关文件或表单 检定菌购买、传代使用记录(SHBD0665) 菌种检查记录(SHBD0666) 灭活记录(S

2、HBD0667)5 定义菌种保藏管：内含特制的小珠多颗和特殊溶液，只需将培养好的菌株接入溶液中，摇匀成菌悬液，菌体即吸附于小珠上，然后吸出溶液，将菌种置于相应的温度进行保存小管。未开封使用的菌种保藏管在包装标签上的有效期之前可保存于10-25,避光保存。6 菌种的管理 6.1 菌种的购买和接收购买的原始菌种管就是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料，包括菌种名称、编号等。接收菌种时应检查安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上关于菌种的所有信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，标明菌种名称、编号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、效期。 6.2菌

3、种的编号将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复温并转至新培养基内生长，即认为已传代一次。从菌种保藏中心获得的冻干菌菌种为第0代，冻干菌菌种开启转种后为第1代。每次接种传代，每支保存菌种需标明菌名、统一编号、传代次数、接种日期、有效期。购进菌种若购进时有编号，延用原编号，于原编号前加菌种名称前两位汉字；若无，用购进日期代替（例：2012年4月9日购进无编号的大肠杆菌菌种，自编号为:大肠120409）。传代编号包括原菌种号传数-管号-珠号，如下： 140201 2 10 10（原菌种号/购进日期） 第二代 第10支保藏管 第10颗小珠6.3 菌种保藏分四个阶段：挑选特

4、征典型的纯菌菌落；确定保藏的合适菌体形态，孢子和芽胞代谢作用较弱，同时对恶劣环境有很强的抵抗力，因此对凡是能产生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽胞进行保藏；选择最适宜的保藏法进行保藏；定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，需改变保藏方法，保藏期满应及时进行移种。 6.4真空冷冻干燥菌种的恢复培养安瓿瓶开封：用浸过75酒精的脱脂棉擦净安瓿瓶，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或镊子敲下已破裂的安瓿瓶顶端。用无菌吸管吸取0.30.5ml适宜的液体培养基，滴入安瓿瓶内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液，接种于12支建议的斜面培养基上，并在建议的温

5、度下培养。菌种活化前，请将安瓿瓶保存在610的环境下。6.5菌种的确认试验无菌水通过火焰2-3次 固定草酸铵结晶紫液用水缓慢况洗染色液,用吸水纸吸干 涂片碘液初染 1-2min媒染 1min95%乙醇脱色 至无色番红染色复染 1-2min水洗、干燥镜检接种少量菌体 在菌种购买后传第一代前进行菌种的确认，包括目测菌落生长情况、染色镜检（如图1）和生化试验，其中，生物试验可选取12个项目进行试验。假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为下一代。见附表A：试验用菌种的确认试验。空气自然干燥水洗后 图1

6、革兰氏染色图示 6.6 菌种的保藏 对需要保存的菌株进行必要的纯化，挑取生长旺盛时期的菌落，接入菌种保藏管中，通常需要接入4-7环。拧上盖子，小心地来回颠倒试管使菌尽可能地吸附到菌子上。用无菌吸管将溶液吸走，尽可能吸干，再盖上试管帽，贴上标签（如下），马上放入冰箱中，温度越低越有利于保存。图2 菌种保存图示金黄色葡萄球菌（CMCC26003）代数：第二代编号：140201-2-10-10操作人/时间：2014年2月10日有效期：2017年2月9日保藏温度：-20图3 菌种标签图例 6.7菌种的复苏 将菌种保藏管从冰柜中取出。不要让小管内融化。若一次取出多支小管可以使用冰袋、保温箱等以防止融化现

7、象，在无菌条件下，打开小管用无菌针或无菌镊子取出一颗小珠，将小珠放在适合该菌生长的平板上滚动或直接置于肉汤中培养，最后，将小珠以污染材料的推荐处理方式安全地丢弃。图4 菌种复苏图示注意事项：1、使用前如果发现保藏液有浑浊的情况，应该停止使用。2、菌种操作应该在无菌条件下进行，防止杂菌的污染。3、多数反复冻融是可以的，但对于一些苛养菌和厌氧菌这样做有可能会影响保存的效果。7 菌种日常管理7.1菌种应置于带锁冰箱中，专人管理。7.2每周检查一次保存菌种的冰箱温度，并作记录，每周检查菌种外观及干燥状态，如有异常应及时处理，并填写菌种检查记录。 7.3应控制传代次数，传代次数越多，突变的几率越大，因此

8、要尽量少传代；采用根据菌种特性和实际保存情况，一般最多传代不超过5代，超过此次数应灭活处理， 7.4 做完试验的菌液以及测量完抑菌圈后的培养皿，阳性菌对照废弃物，要灭活处理。 7.5菌种有异常情况或有杂菌生长，则应随时更代，并可在传代中，选择典型菌种作传代菌种。附表A：试验用菌种的确认试验菌种名称 试验项目目测镜检生化试验（可选做）大肠埃希菌营养琼脂斜面上菌苔通常白色，有时带黄白色，湿润，闪光，蔓延生长为成对和呈短链排列的近球形的杆菌一般不形成荚膜革兰氏染色为阴性明胶穿刺：不液化明胶靛基质试验：阳性甲基红试验：阳性V.P.试验：阴性柠檬酸盐利用试验：阴性金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面上菌苔生长茂盛

9、，半透明，光滑，平坦，湿润，白色至浅黄色或橙色为单个或成对呈短链和不规则堆团状排列的球菌，革兰氏染色为阳性明胶穿刺：呈囊状液化硝酸盐还原：阳性过氧化氢酶试验：阳性铜绿假单胞菌营养琼脂斜面上菌苔生长旺盛，薄，白色，闪光，培养基变为绿色至暗褐色或黑色，发荧光为单个，成对或呈短链排列的杆菌，有运动性革兰氏染色为阴性明胶穿刺：迅速液化明胶，液体呈浅黄绿色或浅蓝绿色吲哚试验：阴性硝酸盐还原试验：阳性枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面上菌苔生长丰厚，粗糙，不透明，不闪光，蜡质，蔓延，奶油色至微褐色为呈链状排列的杆菌不形成荚膜革兰氏染色为阳性明胶穿刺：呈漏斗形至层状液化淀粉水解：阳性硝酸盐还原：阳性生孢梭菌/菌体粗大

10、单独存在或呈短链排列，芽孢比菌体宽，芽孢呈梭形，革兰氏染色为阳性过氧化氢酶试验阳性白色念珠菌改良马丁琼脂斜面上菌苔生长茂盛，光滑，湿润，菌落呈乳白色可见卵形细胞，有多边芽殖现象，有假菌丝/黑曲霉可见分隔菌丝体，分生孢子穗球形，黑色可见分隔菌丝体，分生孢子穗球形，黑色/附表B：试验用菌种的保藏条件与时限菌种培养基培养温度传种时间大肠埃希菌营养琼脂斜面营养肉汤菌悬液菌种保藏管462020 / -703个月6个月4年1-3年 / 10年大肠埃希菌不得多次冷冻传代，否则菌落形态会出现变异，边缘不整齐。金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面营养肉汤菌悬液菌种保藏管462020 / -703个月6个月4年1-3年 / 10年铜绿假单胞菌营养琼脂斜面液体石蜡覆盖保存法菌种保藏管室温室温20 / -703个月9个月2年1-3年 / 10年铜绿假单胞菌保存时，色素会随着放置时间的延长发生亮绿深绿墨绿棕色的变化。无色素时需接种至营养丰富的培养基中划线营养琼脂平板，挑取典型菌落，转种，色素得以恢复。枯草芽孢杆菌营养琼脂斜