第四章DNA重组和基因转移

1、第一节第一节 目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接一一 粘末端粘末端DNA片段片段的连接的连接（一）具有相同粘末端的（一）具有相同粘末端的DNA分子分子 之间的连接之间的连接 使用碱性磷酸酶处理载体使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其去掉其5末端的磷酸基，以防质末端的磷酸基，以防质粒粒DNA的自身环化的自身环化 。（二）（二）具有不同粘性末端的具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接分子之间的连接 用两种不同的限制性内切酶对载体和外源用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接酶连接连接

2、后即产生定向重组体。后即产生定向重组体。 HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI对载体酶切HindIIIEcoRI对基因酶切对基因酶切质粒载体的定向重组质粒载体的定向重组1 直接用直接用T T4 4连接酶连接连接酶连接2 同聚物加尾法同聚物加尾法3 衔接物连接法衔接物连接法衔接物衔接物是指用化学方法合成的一段由是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。所谓载体与所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA

3、片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。造不出可互补的粘性末端。 1 按照平末端连接方法加上接头按照平末端连接方法加上接头2 将凹端变为平端将凹端变为平端（1 1）使用）使用KlenowKlenow酶在酶在4 4种种dNTPdNTP存在下，将存在下，将33凹端完全补平。凹端完全补平。 （2 2）用）用S1核酸酶去除核酸酶去除3突出末端产生平端突出末端产生平端DNA分子分子 3 3 使用大肠杆菌使用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I Klenow片段部分补平片段部分补平3凹端转凹端转 变成粘端。变成粘端。载体经载体经XhoI酶

4、切形成：酶切形成：外源基因用外源基因用San3A酶切形成：酶切形成：用用Klenow酶部分补平二者的酶部分补平二者的3 凹端，形成：凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA这样，就可以实现有效重组。这样，就可以实现有效重组。TCGAAGCT3355GATCCTAG3355通过依次加入、连接合成通过依次加入、连接合成的的DNA接头进行接头进行cDNA克隆克隆外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：（2）（3）（1）转化转化E.coli（一）根据载体表型特征选择重组体分子（一）根据载体表型特征选择重组体分子1 抗药性标记插

5、入失活筛选法抗药性标记插入失活筛选法例：例：pBR322pBR322 如果外源基因插入到如果外源基因插入到tetr基因内部，基因内部，tetr抗性消失，表型抗性消失，表型为不抗四环素（为不抗四环素（tets）、）、而仍抗氨苄青霉素（而仍抗氨苄青霉素（ampr），），这样的这样的转化细胞在含有转化细胞在含有 amp的培养基仍可生长，但在含有四环素的的培养基仍可生长，但在含有四环素的培养基上不能再生长；反之，如果培养基上不能再生长；反之，如果ampr基因由于外源基因插基因由于外源基因插入其内部而失活，带有重组入其内部而失活，带有重组DNA分子的转化细胞在含有分子的转化细胞在含有tet的的培养基平板

6、上生长，在含有培养基平板上生长，在含有 amp的培养基不能生长。的培养基不能生长。 例例: pUC质粒质粒 在在LacZ的大肠杆菌中，在平板培养中，菌落是白色的。的大肠杆菌中，在平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入若在该细胞中引入pUC质粒，其上有质粒，其上有LacZ，质粒和大肠杆质粒和大肠杆菌菌DNA可实现可实现互补，菌落呈蓝色。互补，菌落呈蓝色。 如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则因，则LacZ基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的成有活性的-半乳糖苷酶，因此，菌落

7、呈白色。半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。 （二）（二）根据插入序列的表型特征选择重组体根据插入序列的表型特征选择重组体 进入受体细胞的重组进入受体细胞的重组DNA分子中的外源基因如果在宿主分子中的外源基因如果在宿主细胞中能实现功能表达，产生出有功能活性的基因产物，那细胞中能实现功能表达，产生出有功能活性的基因产物，那么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。 2 互补互补凝胶电泳检测法凝胶电泳检测法例：原位杂交筛选重组例：原位杂交筛选重组体菌落体菌落(或噬菌斑或噬菌斑)免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基免疫化学

8、检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种 。标记抗体测定法的步骤：标记抗体测定法的步骤：转化菌落转化菌落影印平板影印平板置于含氯仿饱合气体的容器置于含氯仿饱合气体的容器细菌裂解，抗原释放细菌裂解，抗原释放覆盖吸附有未经标记的抗体的覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜膜形成抗原抗体复合物形成抗原抗体

9、复合物将将NC膜与膜与I125标记的抗体温育标记的抗体温育 放射自显影放射自显影与母板对照，挑取所需的重组克隆与母板对照，挑取所需的重组克隆 用免疫化学法检测克隆在表达载体用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因上的基因第三节第三节 基因转移方法基因转移方法一一 重组重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌 （一）（一）转化转化 将外源将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。 为了有效地使细菌吸收外源的为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源进行一些物理或化学的

10、处理，处理后的细胞吸收外源DNA的的能力大大提高，被称为能力大大提高，被称为感受态细胞感受态细胞。对于大肠杆菌细胞，一般采用对于大肠杆菌细胞，一般采用50mmol/L的的CaCl2溶液来制备溶液来制备感受态细胞。感受态细胞。（1）吸附阶段：完整的双链）吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面分子吸附于感受态细胞表面 （2）转入阶段：双链）转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，分子解链，以单链形式进入细胞， 而另一链则被降解而另一链则被降解 （3）自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型）自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型 DNA （4）表达阶段：即目的基

11、因随质粒的复制子一起复制，并被表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被 转录、转译转录、转译 DNA分子转化的过程：分子转化的过程：质粒质粒DNA的大小及构型对转化效率的影响：的大小及构型对转化效率的影响：（1）大小）大小 10Kb，转化效率很低转化效率很低（2）构型）构型 超螺旋超螺旋环形环形线状线状转染转染(transfection)：是指感受态的受体细胞捕获和表达以是指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。分子的过程。 （1）转导和转染的区别）转导和转染的区别转导转导(transduction)：通过通过噬菌体（病毒）颗粒感染噬菌体（病

12、毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体转移到受体细胞的过程细胞的过程。 转染：转染：噬菌体噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。分子直接导入受体细胞的过程。 体外包装：体外包装：是指在体外模拟是指在体外模拟噬菌体噬菌体DNA在受体细胞内的一在受体细胞内的一系列特殊的包装反应过程，将重组系列特殊的包装反应过程，将重组噬菌体噬菌体DNA分子包装成分子包装成为成熟的具有感染能力的为成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。噬菌体颗粒的技术。（2）噬菌体的体外包装噬菌体的体外包装（1）基因枪法）基因枪法 80年代末期，由康奈尔大学的年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先

13、提出，主要最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。是为了克服以往各种基因转化技术的局限。该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。 首先将钨、金微粒首先将钨、金微粒(直径约直径约0.4m，重量约重量约0.05mg)与供体与供体DNA溶液溶液(12ll)混合并保温，使混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的后将该溶液置于所谓的“基因枪基因枪”仪器中，仪器高压放电将金仪器中，仪器高压放电将金属微

14、粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的在钨粒上的DNA以及溶液中的以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。都可以进入受体细胞。 操作技术程序为：操作技术程序为：1 物理方法物理方法基因枪示意图基因枪示意图（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。粉大。（2）将）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇

15、、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。（3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。动力。基因枪法的特点基因枪法的特点 （2）受体广泛。）受体广泛。（3）操作简单。）操作简单。（1）转化效率高。）转化效率高。基因枪所用材料：基因枪所用材料：电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。微孔而使基因转移的一种新

16、方法。 原理：原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（一种电容，其静膜电位（Vm）约为约为l00mV，导电性很差。导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。 可逆击穿：可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。击穿小孔可在一定时间内复原。不可逆击穿：不可逆击穿：击穿小孔

17、不可修复，处理细胞成活率低。击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。将盛有细胞和将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在极之间，在0度下加高压（度下加高压（2 4KV），），电脉冲电脉冲10分钟后，将分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再进行筛选。存天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为活细胞的回收率约为60% 80%。操作程序：操作程序：微量注射：微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺随穿刺 孔进入细胞或随穿刺针头孔进入细胞或随

18、穿刺针头道进入道进入。 真正的显微注射：真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNADNA直接注直接注 入细胞质或细胞核的基因转化方法。入细胞质或细胞核的基因转化方法。 常用的细胞固定方法有常用的细胞固定方法有3种：种：一一 琼脂糖包埋法琼脂糖包埋法二二 多聚赖氨酸粘连法多聚赖氨酸粘连法三三 吸管支持法吸管支持法显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。对于植物细显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。对于植物细胞而言，首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。胞而言，首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定

19、位显微注射操作。（5）超声波法）超声波法 此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子分子随之进入细胞。随之进入细胞。基本原理：基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使 外源外源DNA进入细胞。进入细胞。 利用利用超声波处理可避免脉冲高压对细胞的损伤作用，有利于原生质体的存超声波处理可避免脉冲高压对细胞的损伤作用，有利于