细胞增殖及细胞活力检测方法

1、目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability ）检测方法， 通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然， 细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量， 但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处

2、理细胞，再检测dna 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，dna 合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞dna 链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行dna 的合成。但更为常用的方法是brdu 检测法。用brdu 预处理的细胞中，brdu 可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的dna 双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测dna 中 brdu 的含量（如采用鼠抗brdu 单克隆抗体特异识别brdu, 再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠igg 二抗标记， 最后用比色法或荧光的方法进行定量测定） ，从而判断细胞的增殖能力。calbi

3、ochem/emd公司提供一种brdu 检测试剂盒， 以微孔板的形式， 合并所有清洗、 固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm 下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000 个细胞以上水平的检测只需用brdu 预孵育 2小时，100 个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。brdu 法的一个缺点是需要固定和变性等破坏dna 的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总dna 含量， 然而， 在变性条件下， dna 的双链结构将被破坏， dapi 和 hoechest 33342等核

4、酸标记探针就不再能识别dna，因而也无法估计 dna 总量。 molecular probes公司的 click-it edu(5 乙炔 2脱氧尿嘧啶)检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性dna 双链中的edu 分子。采用 brdu 方法时，你必须非常小心的去对dna 进行变性，才能一方面使brdu 抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链dna 分子来进行细胞周期的分析。有了edu 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于dna 变性的 hcl ，可能破细胞内坏蛋白的抗原识

5、别位点，因而限制了brdu 检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在 edu 法中不存在。图1：edu 及 brdu 原理示意图（摘至invitrogen说明书）在一些情况下， 细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，alamar blue ，mtt 及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一种四唑盐试剂 wst-1 来对细胞活力进行快速的检测。线粒体剪切wst 1试剂，产生一种水溶性的

6、 formazan盐，所以这是一种相对可靠的测定健康细胞活力的方法。一种类似的但更为灵敏的方法是calbiochem公司的超敏细胞增殖试剂盒，采用 calcein-am （一种荧光探针）来标记细胞。这种增加的灵敏度来自于额外的检测步骤，即采用pbs 替代培养基或血清来减小背景。invitrogen公司还提供了一种采用荧光素酶检测细胞内atp 水平的方法。 健康细胞中荧光素激发出的光可以很容易读出，并且具有非常小的背景。无荧光信号表明细胞线粒体不在产生atp。因此，这些方法当然也可用于细胞毒性检测实验。细胞增殖检测方法：总论一、胸腺嘧啶核苷（3h-tdr ）渗入法胸腺嘧啶核苷（tdr ）是 dn

7、a 特有的碱基，也是dna 合成的必需物质。用同位素3h 标记tdr 即3h-tdr 作为 dna 合成的前体能掺入dan 合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞dan 的代谢及细胞增殖情况。但是具有放射性。二、 mtt 检测法mtt 检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法，其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的mtt 分解成兰紫色的甲（formazan ） ，生成的甲量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比三、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（cfse ）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（cfse ）是一种可穿透细胞膜的荧光染

8、料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使 c e成为一种良好的细胞标记物。cfse 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，cfse 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm 激发光和荧光检测通道可对其进行分析。四、 brdu 检测法brdu 中文全名 5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在dna 合成期（s 期） ，活体注射或细胞培养加入，而后利用抗brdu 单克隆抗体， icc 染色， 显示增