第九章 同位素示踪技术

1、第九章 同位素示踪技术在反刍动物营养研究中的应用第一节 同位素示踪技术的原理与方法简介同位素示踪是除能量平衡、物质平衡（C、N）试验及相关的化学分析技术之外的另一类动物营养学的重要研究方法。同位素示踪主要应用于营养物质动态代谢过程的观察，这方面的研究用常规技术无法实现。诸如食糜流通量、营养物质吸收等方面的研究，常规研究手段也可以实现，但应用同位素示踪技术可以提高测定的准确性、减少对动物的外科手术处理、重复利用相同的动物或得到更多的信息。另外，同位素研究还是矿物质代谢研究的重要手段。虽然同位素示踪技术的应用受到对仪器设备条件要求较高的限制，但其独特的优越性已使其得到越来越广泛的应用。一. 同位素

2、示踪技术的原理同位素示踪技术在反刍动物营养研究中的用途广泛。如营养物质的消化吸收、食糜的流通量测定、菌体蛋白合成、体组织的合成与分解、器官代谢、矿物质代谢乃至能量代谢和体成分估测等均可应用不同的同位素示踪技术实现。这些同位素示踪技术均利用了同位素原子化学性质相同、物理性质不同的特点，通过示踪原子位置、数量的变化观察物质的代谢。在方法原理上主要有以下三个方面。这些原理的组合运用形成了各种技术方法。 同位素稀释：如测定某种代谢物在代谢池中的总量，在无法测定代谢池总容量的情况下，向代谢池中注入一定数量的同位素标记代谢物，取得代表性样品后测定同位素富集度（比活度），可以计算出池中代谢物总量。假设使用稳

3、定性同位素标记的代谢物进行示踪。注入代谢物的该同位素富集度（某同位素量/代谢物中该元素总量）为，代谢物注入量为；代谢池中代谢物中该同位素的富集度为，代谢物总量为；注入示踪物后代谢池的同位素富集度为。其中、为已知量，、为可测量，求。 则：同时测定池中代谢物的浓度，可以求出代谢池的容积。 物质代谢动力学分析：动物体内代谢池中的代谢物一般处于动态变化之中，向代谢池中注入示踪物，测定池内和流出代谢池的示踪物变化以反映物质的代谢。相关的测定技术及数学计算方法称为动力学分析。代谢动力学分析一般要求代谢池处于恒态或准恒态代谢状态，在反刍动物一般通过连续饲喂和尽可能减少环境对动物的刺激来实现。示踪物的注入方法

4、分一次性注入和恒速连续注入两种，采样方法则分为代谢池内同位素达到稳定后采样和按时间序列采样两种。试验之前，首先需要根据研究目的确定代谢池的数量、之间的关系和各代谢池的含义，即建立房室模型，其次确定示踪物的注入量、注入方法及采样点。试验数据的分析方法的复杂程度随房室数量、示踪物注入方式、采样方式的不同而有很大差别。有关问题将在后续内容讨论。 微量成份代谢：矿物质元素，尤其是微量元素在饲料及体组织中的含量很小，在样品量较小，化学分析的灵敏度不足的研究中，需要利用放射性测量灵敏度高的特点。二. 同位素示踪技术的优点和局限性同位素示踪技术除具有灵敏度高的优点外，应用于动物营养研究的最大优点是可以分别观

5、测代谢物的合成与分解过程，进行动态分析。如利用化学分析方法只能测定血糖的含量，而利用同位素示踪的方法可以测定出血糖产生与消失的速度。其次一些利用传统方法必须进行屠宰测定的研究，利用同位素示踪技术可以在相同的试验动物进行重复试验。同位素示踪技术的局限性主要有以下几个方面： 需要经过特殊训练专业人员的协助：放射性标记物的操作、放射性防护、放射性测量以及稳定性同位素的测量均属专门技术，有关人员需要经过专门的训练。很难要求从事动物营养研究的专业人员同时具备这些方面的专业能力，因此具备同位素示踪研究能力的实验室一般配备专业人员。 对设备、设施条件要求较高：进行放射性操作要求实验室符合安全防护条件。放射性

6、测量及稳定性同位素测量仪器结构复杂、价格较高。在一定程度上限制了同位素示踪技术的应用。 试验费用较高：放射性、稳定性同位素的价格及样品分析费用较高是造成同位素示踪试验费用较高的主要原因。但同位素标记物的用量较少，同位素示踪的试验费用在一般科研项目的承受范围之内。国内同位素示踪技术应用较少的主要原因是实验室条件不足和对同位素示踪技术的了解不够。三. 原子核物理的基本概念 原子、原子核、核素：自然界中的所有物质均是由元素组成的，组成元素的基本单位是原子。原子由原子核和核外电子构成。原子的质量很轻，约为g。原子的质量用原子质量单位表示，1的绝对质量是原子质量的十二分之一，即g。核外电子带负电，每个电

7、子的质量为0.000549。原子核由质子和中子组成，质子带正电，带电量与电子相等，中子不带电。原子核的质子数与核外电子数相等，因此原子呈电中性。质子的质量为1.007276，中子的质量为1.008665，因此原子的质量主要集中在原子核。质子与中子数的和称为核子数，核子数与质子数决定了原子核的基本特征，通常表示不同元素的原子核，称为核素。其中A为核子数，Z为质子数，X为所属元素的名称。元素在元素周期表中的位置是由核外电子数（亦即质子数）决定的，核子数不同而质子数相同的原子属于同一种元素，由于处于元素周期表的同一位置，习惯上称它们为同位素。 放射性同位素、稳定性同位素：原子核是否稳定完全决定于内在

8、因素。原子核内存在质子之间的静电斥力和核子之间的核力。核力是核子（质子、中子）之间的相互吸引力，与电荷无关，强度为电磁力的倍，作用距离只有cm。作用距离超出这一数量级时，核力很快减小近于零，是一种“短程力”。核力具有饱和性，即一个核子只与附近的几个核子起作用，而不与所有核子起作用。存在核力的任意两个核子之间的核力大小大致相等。质子之间的静电斥力是长程力，斥力的大小与质子间距离的平方呈反比。原子核的稳定性与核子数和质子与中子的比例有关，不稳定的原子核总是自发地向稳定状态转变，这一过程称为核衰变。发生核衰变时，原子核放射出带电或不带电的粒子，因此核衰变又称为放射性核衰变。不稳定的核素称为放射性核素

9、，稳定的核素称为稳定性核素，相对于其同位素分别称为放射性同位素和稳定性同位素。 放射衰变类型：放射衰变得类型很多，动物营养研究中常用核素的衰变主要有五种，即衰变、衰变、衰变、衰变及电子俘获。3.1 衰变：放射性核素放射出粒子而变成另一种核素的过程称为衰变。粒子实际上是氦原子核（）。由一种核素放射出的粒子的能量是单一的，但伴有射线的衰变核素常常放射出不止一种能量的粒子。粒子的能量大都在48MeV之间，最大可达10MeV。发生衰变的天然核素的原子序数一般大于82，人工放射性核素很少有发生衰变的。3.2 衰变：放射性核素的一个中子转变为一个质子，同时放射出粒子的过程称为衰变。粒子实际上是电子，为了与

10、核外电子区别，也写成。衰变的生成物有三种，比母体核原子序数大1的子体核、粒子和中微子。核衰变释放出来的能量由三者共同带走，且能量在三者之间的分配方式不固定，因此放射出的粒子的能量在最大值（接近于衰变能）和最小值（接近于零）间形成连续的能谱。3.3 衰变：放射性核素的一个质子变成一个中子并放射出粒子。粒子实质上是正电子，质量、电荷与电子相同，只是带正电。衰变的产物是较母体核原子序数小1的子体核、粒子和中微子。的能量也是一个连续能谱。3.4 电子俘获（EC）：不稳定核素俘获一个核外绕行电子，核内的一个质子转变成中子和中微子。电子俘获过程只产生一个中微子，因而具有单一的能量。许多产生电子俘获的放射性

11、核素同时也产生衰变，如；也有一些能同时产生衰变，如；还有少数核素能同时产生电子俘获、衰变和衰变。3.5 衰变：处于激发态的原子核通过放射出射线回到基态的衰变方式称为衰变。射线是一种电磁辐射，不带电荷。衰变前后核素的原子序数和核子数不发生变化，仅能量状态不同。原子序数和核子数相同，能量状态不同的核素称为同质异能素。射线的能量是不连续的，一个核衰变可能放射出几种不同能量的射线。 放射性核衰变的一般规律4.1 衰变定律：设放射性原子核的初始数目为，经过t时刻后剩余的放射性原子核数目为，则两者之间符合以下关系： (1)设初始的放射性强度为，t时刻后的放射性强度为，两者之间存在相同的关系，即： (2)以

12、上关系称为衰变定律，其中是衰变常数。4.2 半衰期、平均寿命、放射强度单位：半衰期（）是指放射性核素的数量减少到初始数量一半所需的时间，此时。由（1）式可以推导出：(3)经过n个半衰期后，放射强度与初始放射强度的关系为： (4)平均寿命（T）是指放射性原子核在衰变前的平均存在时间，由（1）式可以推导出： (5)4.3 放射强度单位：放射强度是用单位时间内衰变的次数来度量的。1971年第十四届国际计量大会通过的放射强度计量单位是“贝克勒尔”，简写为Bq。1Bq1次衰变/秒。由于历史的原因，习惯上还用“居里”（ci）作为放射强度单位。1ci是指1g镭每秒钟的衰变数，即次。由于居里的单位比较大，常用

13、毫居里（mci）和微居里（ci），单位大小依次递减1000倍。另外还用衰变数/秒（dps）或衰变数/分（dpm）表示放射强度。放射强度大小显然与放射性核素的数量和核素的衰变常数有关。因此由放射性物质的质量和半衰期可以计算出其放射强度。已知放射性物质的质量m和其原子量M，则放射性核素的数量N为， 为阿佛加德罗常数由（3）式，（1）式的微分方程为，而是单位时间衰变得原子核数，即放射强度，亦即放射强度，因此有： (6)在研究物质代谢的同位素示踪试验中，经常使用比活度（specific activity, SA）的概念。其含义是样品中作为示踪物的放射性同位素原子与被示踪的稳定性同位素原子的数量比。由于

14、放射性同位素的放射强度与与放射性同位素原子数之间是线性关系，且所研究化合物中标记原子数与分子数之间的比例是固定的，因此一般用单位质量标记化合物的放射强度表示其比活度，如dpm/mg等。表91 常用放射性核素半衰期核素符号半衰期放射 强度（ci）核素符号半衰期放射 强度（ci）氢312.4年锶9019.9年碳1120.5分碘1318.1天碳145700年铯1342.3年钠2415小时钡13112天硫3587.1天铊2044年磷3214.3天钋210138.4天钾401.3×104年锰562.8小时钾4212.4小时铬5127.7天钙45164天铜6412.7小时铁5945.1天锌652

15、43.8天钴605.24年钼9966.2小时锶8953天钌10339.35天四. 放射性测量方法核辐射探测器的种类繁多，从制作原理上大致分为以下几类： 利用射线通过物质时产生的电离效应进行探测。包括电离室、正比计数器、G-M计数器、半导体探测器、热释光剂量仪等。 利用射线通过物质时激发荧光的效应探测。如闪烁计数器、荧光玻璃剂量仪、契伦科夫计数器等。 利用射线作用于物质引起的化学变化探测。如X光底片、核乳胶、胶片剂量仪等。 利用射线通过饱和蒸汽或过热液体产生电离，蒸汽或液体在粒子路径上凝结，显示出粒子径迹的方法探测。如云雾室、气泡室等。 利用射线通过物体时产生的热效应探测。在动物营养研究中常用气

16、体探测器和闪烁探测器。气体探测器是利用射线经过高压电场中气体时引起气体电离，产生电流进行测量。闪烁探测器包括固体闪烁计数器和液体闪烁计数器，均利用射线引起某些物质发出荧光进行测量。其中液体闪烁测量时，放射性样品与闪烁液混合在一起，灵敏度高、样品容量大，特别适合、等低能辐射体的测量。五. 稳定性同位素的测量一种元素可以有几种不同的稳定性核素，它们的原子序数相同，中子数不同，互称为稳定性同位素。一种稳定性同位素原子数在同位素混合物种所占的比例称为富集度（abundance），用百分数表示。如自然界中的富集度是99.985，表示在自然界中存在的所有氢元素中，99.985是形式的。自然界中某种元素的同

17、位素富集度称为自然富集度（natural abundance）。表92 常用稳定性同位素元素稳定性同位素自然富集度元素稳定性同位素自然富集度氢99.985铁5.820.01591.66碳98.892.191.110.33氮99.63锌48.890.3727.81氧99.764.110.03718.570.2040.62硫95.0硒0.870.769.024.227.58硅92.2123.524.9049.823.099.19稳定性同位素是根据同位素间质量的不同来探测的，相应的分析仪器称为质谱仪。质谱仪的种类很多，大多不是以定量分析为目的设计的。物质代谢的同位素示踪研究中需要对同位素或同位素的比

18、例进行定量测定，使用的测定仪器主要有两种：气相同位素比质谱仪（gas isotope- ratio mass spectrometry, IRMS）和四极气相色谱质谱仪（quadrupole gas chromatograph- mass spectrometer, GCMS）。两种仪器均是对同位素的比例进行测定，虽然在测定技术上有明显差别，但基本测定原理相同。样品通过阀门以气体形式引入真空腔（电子发射源），也有以用固体或液体形式引入的，但这种设计一般不用于同位素比例的测定。样品在发射源中被离子化，然后进入质量过滤器（分析器）中。在分析器中，无论样品以何种形式引入发射源，均为气态。有不同形式的

19、分析器，但各种分析器均根据质荷比（）分离各种离子。分开的离子分别被探测器（detector）收集，在这里离子流打到金属板上脱去电荷，形成可测电流。目前的探测器已达到很高的灵敏度，以至可以探测到单个离子。打到探测器上的离子数与产生信号的幅度直接相关。如质量为44的和质量为45的可分别形成离子流。测定输出信号的幅度大小，可以计算出含有两种不同C同位素的比例。同位素的富集度可由质谱仪测定出的同位素比计算。样品的同位素富集度通常表示为。如果测定出的样品同位素比是，参比气体的同位素比是，由下式计算： （7）上式的含义是：样品中的某种同位素的比例相当于向含有1000个该同位素的参比气体中加入个同位素原子后

20、达到的比例。用于代谢动力学研究不方便，常用的富集度表示方法是原子百分超 （atom percent atom excess，APE）。APE的定义如下： (8)上式的含义是：向元素的同位素混合物中加入一定量的某种同位素，加入的同位素原子数占加入同位素原子数与原同位素混合物中非该同位素的其它同位素原子数之和的百分比。和APE的含义均与放射性同位素示踪中使用的术语比活度（specific activity, SA）不同。SA的含义是放射性标记的示踪分子与被示踪分子的比例，稳定性同位素示踪的富集度与之含义相同的表达是加入示踪物后样品的同位素比与加入示踪物前样品同位素比之差：标记物/被示踪物（trac

21、er/tracee，R） （9）第二节 物质代谢动力学分析在动物营养研究中，出于不同的研究目的，有时需要测定某种代谢物产生和（或）消失的速度，以及转变为不同产物的比例。如测定瘤胃中VFA的产生与消失速度、体内氨基酸在合成蛋白质与分解之间的分配等。这类问题需要对代谢的动态过程进行观察，通称为物质代谢动力学研究。根据研究对象的不同，首先建立问题的房室模型。根据房室的数量，模型可分为单室模型和多室模型；根据物质代谢是否处于恒态（产生与消失速度相等，浓度不变），又分为恒态和非恒态模型。最简单的模型是恒态单室模型。如在连续饲喂条件下测定瘤胃中某种VFA的产生、消失速度，测定血液葡萄糖的合成、分解速度等均

22、可采用恒态单室模型。一单室模型分析 连续注入（constant infusion）示踪物时的恒态单室模型以测定恒态代谢下瘤胃乙酸的产生速度为例说明连续注入示踪物时恒态单室模型的有关计算问题。为了测定瘤胃乙酸的产量，建立以下模型： 图91 测定瘤胃乙酸合成速度的恒态单室模型为瘤胃液中乙酸分子总量；是瘤胃液体积；、分别是乙酸合成和消失的速度，单位是个分子/min.。定义速度常数。恒态代谢条件下，、可认为不变，此时、用质量/时间单位（如mg/min.、摩尔数/min.），用质量单位（如mg）表示不改变值。而用浓度单位（如mg/ml）时速度常数变为。向瘤胃液中以稳定的速度注入放射性标记的乙酸，如14C

23、乙酸。相对于乙酸的产生速度，注入14C乙酸很小，一般不致影响和值，可以认为这两个参数未因注入标记物而改变。经过t时刻的14C乙酸注入后，瘤胃液中14C乙酸的分子数量为，14C乙酸从瘤胃液中消失的速度为。14C乙酸与瘤胃中合成乙酸的化学性质、吸收性质相同，具有相同的值。则与之间存在以下关系： (10)刚开始注入标记乙酸，随注入的持续进行而增加，则随的增加而增加，直至，即标记乙酸的消失速度与注入速度相等，达到稳定，此时称为同位素平衡（isotopic equilibrium）。以、表示同位素平衡后瘤胃液中标记乙酸的分子数和消失速度，对于瘤胃液中注入的标记乙酸和合成的乙酸，分别存在以下关系：对于注入

24、的标记乙酸 (11)对于合成的乙酸 (12)(11)与(12)式两端分别相除，得：(13)是同位素平衡后瘤胃液中注入的标记乙酸与合成乙酸的比例，即比活度。由(13)式，乙酸的合成速度由下式计算： (14)试验中，标记乙酸的注入速度通常以dpm/min.为单位，达到同位素平衡后取数个瘤胃液样品，测定样品的比活度样，试验前取瘤胃液样品测定背景的比活度背景，（14）式中的由样背景得出。样品比活度的测定一般是测定待测样品中乙酸的浓度和一定数量样品的放射强度，计算出每毫克乙酸的放射强度（dpm/mg）。由此得出的比活度与的定义有差别，放射强度与14C乙酸分子数的数量关系是固定的，因此dpm可视为14C乙

25、酸分子数的单位，但由浓度与体积成绩得出的测定样品中乙酸的含量包括了14C乙酸，因此实际得出的应是14C乙酸与样品中乙酸分子总数的比例P，在14C乙酸的比例很小的情况下与比活度值的差别可忽略。从以下的推导可以看出，用注入前后样品的P之差计算的较之用比活度差计算更接近真实的。对于某一样品，其值与比活度的关系如下： (15)设:注入14C乙酸之前瘤胃液中乙酸的比活度为，14C乙酸在乙酸中的分子数比为；达到同位素平衡后瘤胃液中乙酸的比活度和14C乙酸的比例分别为和；注入瘤胃的乙酸的比活度和14C乙酸的比例分别为和；如注入的乙酸中只有14C乙酸，则为，为1。用于分析的样品中含有m个乙酸分子，其中来自注入

26、和瘤胃发酵产生的乙酸分子数分别为和。可以建立以下方程： 解以上联立方程，求出和： 中14C乙酸的分子数为：按照（13）中的含义，即： 注入乙酸中主要是14C乙酸，大大高于，因此： （16）按（15）式，将换为： 将分母中、忽略后才有。因此使用（16）式更为准确。下面给出描述开始注入14C乙酸后，瘤胃液中乙酸比活度随时间变化的数学公式。 , ,图92 推导乙酸比活度随时间变化的模型其中：、为瘤胃中乙酸的合成速度，为速度常数，为瘤胃液中合成的乙酸量，为瘤胃液中乙酸的浓度，为瘤胃液的表观体积，为时刻t瘤胃液中注入的14C乙酸量瘤胃液中14C乙酸的数量随时间变化的微分方程为：，属一阶非齐线性方程，通式

27、为，通解为。微分方程的解为： 当t=0时，0，带入上式得。因此： (17)由定义：，且，代入（17）式得： (18)；其中。 一次注入（bolus injection）示踪物时的恒态单室模型仍以瘤胃乙酸产生速度的测定为例，向瘤胃中一次性注入一定量的14C乙酸，瘤胃液中注入14C乙酸的存留量随时间t而减少两者之间的关系为：，该微分方程的解为：，当t0时，等于注入的14C乙酸量，因此有：ln*Mtln*M0kt，变形得： (19)，SAt与时间t的关系为：SAtSA0 e-kt (20)，SA0为零时刻乙酸的比活度，等于。一次注入总量为的14C乙酸后，时刻t的14C乙酸从瘤胃中消失的速度v为： (

28、21)14C乙酸瞬间消失的数量为： (22)经过0的时间后，注入的14C乙酸全部从瘤胃中消失，即： (23)瘤胃中乙酸产生的速度，代入（23）式并变形得： (24)由上述推导，一次注入14C乙酸时瘤胃乙酸合成速度Ra的测定方法是：在注入后的不同时刻点采集瘤胃液样品，测定乙酸的比活度SAt并记录准确的采样时刻t，得到的两组数据按（20）式进行数据拟和，求出方程中的系数项，按（24）式求出Ra。一次注入方法的采样次数较连续注入多，且需要记录采样时间，Ra的计算方法也较为复杂。但该方法可以得出更多的信息。连续注入方法只能计算出Ra，一次注入方法可以同时计算出V和k。拟和出的（20）式的常数项即是SA

29、0，而，已知，因而可求出CV，测定瘤胃液乙酸浓度C，得到瘤胃液的表观体积V。k值是（20）式中e-kt项的常数，可直接由拟和结果得出。在代谢动力学研究中，观测示踪物的动态变化过程较之在同位素达到平衡后观测可以得到更多关于系统特性的信息，相应的测定方法也较复杂，这在后面系统辨识方法的讨论中可以更清楚地了解到。 非恒态单室模型1959年Steele用连续注入示踪物的方法测定了注射胰岛素对葡萄糖合成的影响，这是测定非恒态代谢合成速度的第一个试验。Steele按单室模型推导了有关计算公式，并且假定室中葡萄糖是均匀分布的，注入的标记葡萄糖能即刻与室中的葡萄糖混匀，从室中消失的葡萄糖（或标记原子）不再回到

30、代谢室中。前面关于恒态代谢时计算公式的推导实际上也假定了同样的条件，因此Steele推导的公式适合于可用单室模型描述的所有底物代谢动力学的研究。图93是理想单室模型及使用符号的含义。其中Gb是室中注入的标记葡萄糖量、Gt是室中的葡萄糖总量、E是室中标记葡萄糖与非标记葡萄糖的比例。容积浓度标记葡萄糖量合成葡萄糖量 Ra(葡萄糖合成速度) （消失速度） I (标记葡萄糖注入速度)图93 理想单室模型由定义，GbE×Gt，微分该式即得到室中标记葡萄糖量随时间变化的微分方程：dGb/dtEt dGt/dtGt dEt/dt (27)室中合成葡萄糖量的增减决定于葡萄糖的合成和消失速度： dGt

31、/dtRaRd (28)室中标记葡萄糖的增减决定于标记葡萄糖的注入速度和消失速度，其消失速度为Rd×E： dGb/dtIRdEt(29)将（28）、（29）式代入（27）式： IRdEtEt (RaRd)Gt dEt/dt IRaEtGt dEt/dt RaEtIGt dEt/dt Ra(IGt dEt/dt)/ Et(30) RdRadGt/dt (31)用（30）、（31）式估测Ra、Rd时，在不同的时刻点采样测定Et、葡萄糖浓度Ct，葡萄糖的总量Gt是浓度Ct与分布体积V的成绩。Steele在研究过程中认识到体液中的葡萄糖不是均匀分布的，引入了因子p校正体积V，使用下式建立方程

32、：RaFpV（C2C1）/2（E2E1）/(t2t1)/（E2E1）/2 (32)RdRapV(C2C1)/ (t2t1) (33)其中C2、C1，E2、E1、t2、t1分别是在时刻t2、t1采得样品的葡萄糖浓度和标记葡萄糖与葡萄糖总量的比。用单室模型是否能客观地描述真实的代谢情况主要决定于代谢物的分布是否符合理想单室模型的假设。体内水的代谢最接近理想单室模型。仅存在于血清中的底物，如游离脂肪酸（FFA）的代谢也接近理想情况，但研究表明，即使FFA的代谢，由于采样位点和示踪物注入位点的不同，样品富集度也有2030的差异。葡萄糖是研究最多的代谢物，多年来一直认为葡萄糖是适宜于用单室模型描述的代谢

33、物。一次注入标记葡萄糖的研究表明，用2或3室模型方程拟和得到的富集度-时间曲线优于用一室模型方程拟和。这表明体液中的葡萄糖是在多个容易混匀的代谢室中分布的。已经证实，血清和组织液中葡萄糖的代谢动态特性不同，应将其区别为两个不同的代谢室。对于存在于血清和组织液中的代谢物至少应视为存在于两个不同的代谢室中，而对于能由多种组织产生的代谢物，其情况可能更复杂。二. 多室模型分析 房室个数的确定：由于单室模型的局限性，对于一些代谢过程需要采用多室模型来描述。室的个数和室与室之间的关系可根据示踪试验数据的拟和结果和对代谢过程的分析确定。一般情况下室的个数与推导出的富集度-时间函数中的幂函数个数相同，因此用

34、含有不同个幂函数的方程拟和示踪试验数据有助于确定室的个数。由代谢过程考虑室的个数主要考虑两个方面，一是室与室之间存在物理间隔，比如血清和组织液被毛细血管壁所分隔，两种体液中的代谢物可以发生交换，但交换的速度与代谢物的性质有关。二是代谢物之间发生相互转变，如研究丙酮酸的代谢时，标记的丙酮酸能很快地转变为标记乳酸，经过不同途径代谢，需要将丙酮酸和乳酸作为不同的代谢室对待。室与室之间根据代谢物的流动方向连接，两个室之间有相互的代谢物流动时用一对逆向的箭头连接，在某个室中有代谢物的不回流消失时用向外的箭头表示。箭头上的kij表示代谢物流动的速度常数，其中i是代谢物流入的室，j是代谢物流出的室，代谢物不

35、回流消失的方向用0表示。图94是两个房室模型举例。 k12 k31312 k21 k13k41 k144 k04 k21 k32 k424321 k21 k23 k34 k01 k04图94 房室模型举例上图的模型称为分支模型，外周的三个室均与中央室连接，相互之间不连接。下图的模型称为链接模型，各室之间依次连接 描述房室模型同位素富集度变化的函数房室模型确定后，描述注入示踪物后代谢物同位素富集度-时间变化曲线的函数关系随之确定，按函数关系拟和测定出的富集度-时间值，可以计算出所需的代谢物的动态代谢参数。推导函数关系的一般步骤是：列出富集度随时间变化的微分方程；拉普拉斯变换微分方程为线性代数方程

36、；逆拉普拉斯变换得出微分方程的原函数。如对图95的二室模型，原函数的推导过程如下：k21M2C2V2M1C1V1 f10 k02k12图95 二室模型、分别代表室中代谢物的数量、浓度和分布体积，标记物的数量用表示，富集度用表示，且。是描述标记物注入的函数，当一次注入Z0剂量的标记物时，用冲量函数描述标记物的注入，即f10Z0（t），且t0时，（t），t0时（t）0，并有；连续注入标记物时，f10用单位阶跃函数描述，即f10Z0u(t)u(tT)/T，且当t<0时，u(t)0，当t0时，u(t)1，其中T是连续注入的持续时间。冲量函数的拉普拉斯变换为Z0；单位阶跃函数的拉普拉斯变换为.注入

37、示踪物后，各室内标记物数量Mi(t)随时间变化的微分方程为：一次注入标记物时以上方程组的拉普拉斯变换形式为：移项后得：将、视为未知数，其它为常数，用线性代数的方法解以上方程组得： (34) (35)用待定系数法，令(sk21)(sk12k02)k21k12(s)(s),则有：k21k12k02 (36)k21k12 (37)令： (38) (39)则有：A1Z0(k12k02)/( -) (40)B1Z0(k12k02)/( -) (41)A2Z0k21/( -) (42)B2Z0k21/(-)(43)形如a/(s)的逆拉普拉斯变换为，因此各室中标记物数量随时间变化的原函数为： (44) (4

38、5)定义室中代谢物的富集度为，而，则各室代谢物富集度随时间变化的函数关系为 (46)(47)连续注入示踪物时，f10用单位阶跃函数描述，此时（34）、（35）式中的Z0变为Z0（1eTs）/Ts，其中T为注入持续的时间。（38）、（39）式相应变为： 变形得： (48) (49)1/s的逆拉普拉斯变换为1；1/ (sa)的逆拉普拉斯变换为；eTs /s的逆拉普拉斯变换为u(tT)；eTs / (sa)的逆拉普拉斯变换为，当t<T时u(tT)0，当tT时u(tT)1。（46）式第一项的逆拉普拉斯变换为：(A1/ T)( 1eTs)1/s1/ (s)(A1/ T)（1/s1/ (s)eTs

39、/seTs / (sa) 当t>T时：当tT时，令：(46)、(47)式的其它各项形式相同，因此连续注入示踪物时，各室代谢物富集度随时间变化的函数为：当t<T时： (50) (51)当tT，亦即停止注入示踪物后：(52)(53)在以上二室模型中，如果室一可测而室二不可测，即可以从室一取得样品测定代谢物富集度随时间变化的曲线但不能从室二取得样品。由对室一的测定结果可以估计模型中的各个参数。一次注入示踪物时的估计方法如下：首先，在注入示踪物后的不同时刻点采样，测定室一的代谢物富集度-时间曲线，对测定结果按（46）式进行数据拟和，由拟和结果估计出A1、B1、。由（36）、（37）、（40

40、）、（41）式可估计出各。将（46）式外推至t0，此时，即。C2V2只有当室二可测，并向室二注入标记物时才可估计。连续注入示踪物时，一般在注入示踪物的同时采样，按（52）式拟和测定结果，由拟和结果估计。C1V1在将拟和出的A1、B1、代入（46）式后按一次注入标记物的方法估计。一般地，不同模型代谢物富集度-时间函数的形式与以上二室模型相同，幂函数的个数与模型中室的个数相同，函数式中的系数项是各速度常数、室容量、注入剂量、注入持续时间的代数表达式。参数是否可以估计与模型及模型中各室的可测情况有关。这种通过测定富集度-时间曲线，按推导出的函数关系拟和测定数据估计参数的方法称为系统辨识。三. 启动注

41、入(priming the pool）剂量的确定相对于示踪物连续注入的速度，如果代谢室中底物的数量很大，往往需要持续数小时甚至更长的时间才能达到同位素平衡。时间越长，维持动物安静和生理状态不发生变化的难度越大。因此一般希望能尽快达到同位素的平衡。1954年，Searle首先采用了启动注入与连续注入相结合的方法，即首先向动物体内一次注入一定量的示踪物，使代谢室的SA接近平衡时的SA，接着进行连续注入，缩短了达到同位素平衡所需的时间。之后用这一方法研究了包括乳酸、甘油、脂肪酸、氨基酸、尿素在内的多种物质的代谢，证实启动注入不影响最终同位素平衡的SA。启动注入的示踪物剂量为，连续注入的速度为，开始注

42、入后时刻t代谢物的比活度为SAt，由（18）和（20）式： (25)，其中，；当t时，b，即启动注入结合以速度连续注入达到同位素平衡后的SA与单纯以速度连续注入达到同位素平衡后的SA相同。理想的启动注入剂量是即刻达到同位素平衡，亦即将t0代入（25）式得到SAtb。t0时，e-kt1，代入（25）式：bb×（11）SA0 ×1SA0，由b和SA0的含义：，变形： （26）上式说明理想的启动注入剂量应是：启动注入剂量与连续注入速度的比是代谢物消失速度常数的倒数。注入启动剂量的示踪物后，代谢物的即刻SA是连续注入达到同位素平衡后的SA。启动注入剂量高于或低于理想剂量均能延长到达

43、同位素平衡的时间，一般注入的启动剂量越接近理想剂量、速度常数k越小，启动注入的效果越好。估计理想启动剂量的方法有两种，一是估计代谢物的总量（CV）和消失速度，由估计k值；二是通过预试估计。第一种方法虽然不需要试验，但有可能产生较大的误差。原因是在以上的推导中由一次注入的示踪物可以与代谢室中的代谢物即使混匀的假设，这只是理想的情况，实际是不存在的。图96是启动注入剂量等于、低于、高于理想剂量时SA随时间变化情况。启动剂量等于理想剂量启动剂量低于理想剂量启动剂量高于理想剂量 图96不同启动注入情况下的SA曲线第三节 同位素示踪技术应用举例本节重点介绍了同位素示踪技术在反刍动物营养研究中几个方面的应

44、用方法。一. 蛋白质代谢测定蛋白质合成、分解速度的同位素示踪方法可分为三种。终端产物法是在同位素平衡后测定氨基酸室的周转速度，通过测定氨基酸分解代谢的某种终产物的产生速度确定氨基酸合成到蛋白质中的速度和蛋白质的分解速度，一般用于机体水平蛋白质代谢速度的测定。前体底物法通过测定一段时间内标记氨基酸合成到组织蛋白中引起的富集度变化测定组织蛋白的合成速度，此时得到的合成速度一般用每天合成的蛋白质量占该组织蛋白总量的百分比表示（ %/天），称为蛋白质合成比速度（fractional protein synthesis rate, FSR）。动静脉差法适用于有独立的回流静脉，并可做插管的组织，通过流入和

45、流出组织的标记氨基酸数量差别测定蛋白质的合成速度。3甲基组胺酸法是利用肌肉蛋白分解代谢产生的3甲基组胺酸测定肌肉蛋白的分解速度，该方法是一种非同位素示踪方法。 终端产物法 根据示踪氨基酸的性质，终端产物法分为非必需氨基酸示踪法和必需氨基酸示踪法。非必需氨基酸示踪法是向体内注入某种15N标记的非必需氨基酸，通常用15N甘氨酸。由于转氨基作用，由此引入体内的15N对其它氨基酸进行了标记，从而对体液氨基酸的代谢进行示踪，以由尿排除的尿素或氨N作为测定氨基酸分解速度的终产物。必需氨基酸示踪法是向体内引入某种标记的必需氨基酸，标记原子可以是C或N，但必需能够反映该必需氨基酸的代谢情况，用于测定氨基酸分解

46、速度的终产物是标记CO2或尿素（氨N）。1.1 15N甘氨酸连续注入方法（终端产物法）：该方法由Picou和Taylor Roberts于1969年提出，测定条件是同位素平衡和恒态代谢，测定指标是氨基酸的吸收速度和尿中排除尿素（或氨N）的速度及富集度（15N/N）。（1）原理：该方法的原理见图97。消化道吸收I C由尿排出的氨基酸N体液氨基酸N体蛋白 E S15N甘氨酸F图97 连续注入15N甘氨酸活体测定蛋白质的合成与分解速度原理图中C为蛋白质的合成速度(mgN/h)；S为蛋白质的合成速度(mgN/h)；E为由尿排出氨基酸N的速度(mgN/h)，由测定平均每天由尿排出的尿素及氨N数量除24小

47、时得出；I为由消化道吸收氨基酸N的速度(mgN/h)，由每天平均吸收量除24小时得出；F为15N甘氨酸N的注入速度(mgN/h)，为已知量。试验条件是恒态代谢，即测定过程中图中的各速度不变，一般可通过连续饲喂和减少环境刺激使动物接近恒态代谢。恒态代谢时，体液氨基酸N的室容量不变，即有：CISEQ (1)其中Q为蛋白质的周转速度。连续注入15N甘氨酸达到同位素平衡后，体液氨基酸N的15N/N比与由尿排出氨基酸N的15N/N比相等，因此可以通过测定尿中尿素或氨N的15N/N比得出体液氨基酸N的15N/N。令R15N/N，达到同位素平衡后，15N的注入量等于排出量，即有：F(SE)R，即：QSECI

48、 =F/R，室中E、F、R、I均为已知或可测量，因此蛋白质的合成和分解速度可由下式求出：SF/RE (2)CF/RI (3)上式的单位为mgN/h，若要转换为蛋白质的mg数，将上式计算结果乘以6.25即可。（2）方法的假设：在以上推导过程中，暗含以下假设，这些假设与实际情况不完全相符，影响了测定的准确性。a、 严格的恒态代谢，测定过程中体液氨基酸N的室容量不变；b、 合成到体蛋白的15N不再分解成氨基酸重新回到体液氨基酸室中；c、 同位素的化学性质完全相同；d、 吸收的氨基酸与蛋白质分解产生的氨基酸在代谢上没有差别；e、 15N甘氨酸是有效的示踪物。试验持续的时间越长，维持恒态代谢的难度越大，

49、室容量有可能发生较大变化。同时随连续注入的延长，再循环15N对结果的影响增加。注入15N甘氨酸，达到同位素平衡约需3040小时，缩短平衡时间需要对体液氨基酸和尿素室进行启动注入。15N甘氨酸的注入速度为0.2mol/kg/min.时，启动注入12mol/kg的15N甘氨酸可使体液氨基酸室达到平衡。目前生产的15N标记尿素的两个N原子均被标记，而注入15N甘氨酸后体内合成的标记尿素只有一个N原子被标记，因此缺少直接启动注入尿素室的标记物。替代的方法是用15N甘氨酸进行间接启动注入，此时15N甘氨酸的启动计量需达到720mol/kg，虽可有效地缩短尿素室达到同位素平衡需要的时间，但使用剂量大大超出

50、示踪剂量，注入的15N甘氨酸可能影响体液氨基酸的恒态代谢。另外的方法是测定由尿排除氨N的15N/N比，由于氨N的室容量小且周转速度快，达到同位素平衡所需时间少，不需要启动注入。但尿中的氨N主要来自谷氨酰胺的酰胺N，作为反映体液氨基酸N同位素富集度的终端产物不理想。1.2 标记必需氨基酸连续注入方法：可利用的标记氨基酸有多种。一些氨基酸在分解代谢过程中产生唯一来源的酮酸，可通过测定这些酮酸的富集度反映细胞内（直接用于蛋白质合成）该氨基酸的富集度，这类必需氨基酸有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。另一些必需氨基酸不产生唯一来源的酮酸，只能由血浆中该氨基酸的富集度反映细胞内该氨基酸的富集度。与非必需氨基酸不同的是，必需氨基酸的标记原子必须不能转移到其它氨基酸分子上，具有唯一性。符合这一条件的C、N原子均可。对C原子进行标记时，测定的终产物是CO2，对N原子标记时，测定的终产物是尿素或氨N。(1) 13C亮氨酸连续注入：该方法的测定原理见图98。细胞内 血浆蛋白质 C S13C亮氨酸 E*异己酮酸（*KIC） 13CO2异戊酰辅酶A I13C亮氨酸 F 图98 连续