重组人干细胞因子工艺研究

1、重组人干细胞因子工艺研究专业班级姓名学号摘要 人干细胞因子(human stem cell factor, hscf)是一种重要的造 血细胞因子，该文章在重组hscfz程菌的基础上，通过高密度发酵培养、 包涵体分离纯化、变复性、spsepharose ff>source 30rpc 与 qsepharose ff层析等技术分离纯化出具有生物学活性的重组人干细胞因子，建立了适 合大规模生产重组人干细胞因子的分离纯化工艺。关键词组人干细胞因子包涵体复性分离与纯化生物学活 性分离纯化工艺人干细胞因子(human stem cell factor, hscf)又称为肥大细胞生长因 子(mast

2、cellgros vih factol mgf)> kit 配体(kit ligand, kl)及 steel 因子(steel factolsl),为ckit原癌基因编码受体的配体蛋白，是自1990年发现的一 种重要的细胞因子。它能够刺激早期造血干细胞及祖细胞增值，是造血干 细胞增值分化的关键因子llhscf能刺激造血细胞的生长、增生与分化。 它可以与其它造血因子共同发挥作用，如与白细胞介素-3(il-3)>白细胞介 素6(il6)、集落刺激因子(g-csf)、促红细胞生成素(epo)等表现出较强的协 同效应，临床上scf可用于治疗一系列原发性或继发性的(因毒性、辐射免 疫损伤造

3、成的)以髓细胞亚群数目减少为特征的干细胞功能异常等类型的 疾病【24】。具有广阔的应用前景和药用开发价值。正是由于scf具有广阔的应用前景，所以对它的需求也很大，但是其 天然来源有限，成熟型可溶性scf(scf165)在人体或动物体内含量甚微，在 血中的浓度为3.3ng/ml,故不可能从天然组织中分离纯化足够量的样品进 行实验室和临床应用研究【5】。大量实验证明，人scf的糖基化对其活性 不是必需的，如此就可以用基因工程方法，使用大肠杆菌等表达体系来生 产重组人scf(rhscf),以此來解决这个难题【6】。国内外多家研究单位或生物制药公司已从多方面开展重组人干细胞 因了的开发与研制目前在美国

4、主要有两家公司(amgen和immunex 公司)从事rhscf的研制，其中amgen公司采用人肠杆菌表达系统，而 immunex公司主要采用酵母表达体系。amgen公司产品于1994年己基本 完成临床i、ii期研究，于1997年完成临床iii期研究，并通过fda的审批。 现在rhscf已在澳大利亚和加拿大限制性地上市。国内军事医学科学院生 物工程研究所采用rhscf制备工艺，经过rhscf包涵体复性，deae阴离子 交换层析吸附、浓缩，再经s-200凝胶层析和疏水层析，最后利用g25脱 盐柱得到rhscf样品，其生产工艺采用四步柱层析，工作量大，得率相对 较低。因此应加快这方面的研究，冇望在

5、不远的将來，使我国的基因工程 新药产品中能够增加rhscf新成员【12】。1、scf的生物学功能【5】(1) > scf的结构与物化性质：天然干细胞因子是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋 白，共有273个氨基酸，既有n糖基化，又有0糖基化位点，相对分子质 量为31, 000-36, 000,由非共价结合的两个相同亚基组成，等电点(pi)为 3.8,含有5个半胱氨酸残基，形成两对二硫键(cys4-cys39和cys43-cysl33)o 非糖基化的scf分子量为18,000o鼠与人的scf有83%的同源性【13】。scf在小鼠由10号染色体steel位点编码,在人位于ioq222

6、4。scf的两种 存在形式，一种为可溶性，即scf可被分泌到细胞外的条件培养液屮；另 一种为膜结合形式，两种形式均有生物学活性。鼠和人scf对人造血细胞 几乎有相等的生物学活性，但对鼠细胞，鼠scf比人scf生物学效应强800 倍【14】。(2) 、scf的牛物学活性：重组scf和天然scf有着相同生物学活性。scf独自不能促使造血祖 细胞的分化，但能够增强造血细胞的增殖潜能，可能是scf激活最早期的 多能造血干细胞，所以表现为对各种造血调控因子的协同作用15-1602、重组人干细胞因子的生产工艺要对重组人干细胞因 了(recombinant human stem cellfactor.rhs

7、cf)的牛 产工艺进行研究，包括重组大肠杆菌的培养基、摇瓶培养条件和发酵罐间 歇培养的发酵生产，以及目标蛋白的分离纯化。(1) 、发酵培养基通过摇瓶发酵对用大肠杆菌(ecdfj)dh5 o/pbv220生产rhscf的发酵培 养基进行了研究。首先从几种常用的培养基中筛选出m9培养基是最适合 工程菌生长和rhscf表达的培养基，然后乂采用单因子实验方法对m9培 养基中的碳源和氮源进行了逐个筛选，结果表明，最适合工程菌dh5 o/pbv220生长的碳源为葡萄糖，氮源为蛋口月东和酵母粉，最后设计止交试 验，对培养基配方进行了优化，确定出较适合的培养基，同时在培养基中 添加了 m92以加速菌体的牛长o

8、 rhscf工程菌釆用b.braun d50(容积为70 l)发酵罐发酵,所用培养基为lb培养基，在培养温度32°c、诱导温度42 °c、 ph 7.0、po2 30%50%等条件下进行培养，每小时取样检测a600nm,当 a600nmn达12时，培养温度升至42°c诱导3 h,离心收集菌体，采用 sds. page检测rhscf的表达水平及表达形式。(2) 、rhscf的分离纯化 、包涵体的分离纯化：离心收集高效表达工程菌菌体，破菌缓冲液 悬浮后用高压均质机进行破菌，离心收集沉淀。沉淀分别用溶液a(10 mmol/ltris-hci> lmmol/ledt

9、a, ph8.5)和溶液 b(10 mmol/ltris-hck 1 retool/ledta. l%tri-tion x-100, ph 8.5)进行洗涤，收集包涵体，洗涤条 件为:室温下搅拌lh, 9 000 r/min离心30 min。纯化的包涵体用溶液c(50 mmol/ltris-hci> 7 molflgu-hck 10 mmol/l d,ltr,ph8.5)室温下搅拌溶解 3 h, 9 000 r/min离心30 min,收集上清液置于层析柜中备用。 、包涵体复性：将蛋白变性液缓慢滴加入复性缓冲液(2 mol/lurea>20 mmol/ltris-hcl 1 mmo

10、l/l edta, ph8.5)中,使蛋白浓度逐渐稀释到 0.2 mg/ml,室温下搅拌复性30 h,复性结束后超滤浓缩得到rhscf,粗蛋白样品。 、分离纯化：超滤浓缩样品用稀醋酸调节ph为4.5左右，上样于用 20 mmol/l醋酸缓冲液(ph 4.5)预平衡的sp-sepharose ff柱，分步洗脱，收 集0.4 mol/l naci洗脱峰.将此洗脱峰稀释后用稀盐酸调节ph为2.5,上 样于用10 mmol/l盐酸缓冲液(ph 2.5)平衡source 30rpc反相柱，收集60% 乙醇洗脱峰并在稀释后用磷酸氢二钠调节ph为7.0,上样于10mmol/l磷 酸缓冲液(ph 7.0)预平

11、衡qsepharose ff柱，分步洗脱，收集0.3 mol/l naci 洗脱峰，即得到重组蛋白样品原液，除菌后样品原液于20°c保存备用。(3) 、重组蛋白的检定 、蛋白含量测定：采用lowry法测定，以牛血清白蛋白为对照。 、高压液相法(hplc)测定蛋白纯度：采用symmetryc8,以a相(三氟 醋酸一水溶液)及b相(三氟醋酸一乙氧溶液为流动相)，梯度洗脱，检测波 长280 nm,理论塔板数不低于2000,按归一法计算峰面积，进行纯度分 析. 、生物活性测定：采用u7细胞依赖珠/mtt比色法，在570/650 nm 处测定0d值，采用四参数方程法计算出rhscf比活性单位【

12、17】。 、重组蛋白的稳定性考察：通过此纯化工艺所得3批冻干样品，按 制剂配方配制成成品考察稳定性，分别在0、3、9、12、18、24月时间点 取样，测定制剂的外观、水份、生物学活性等相关指标。结果讨论：hscf具有广泛的临床应用领域和价值。由于天然hscf来源及制备有 限，因此，利用基因工程和发酵技术大规模制备rh-scf成为生物医药行业 满足临床应用的必需途径。从hscf的分子结构分析，天然表达的hscf是 一种糖基化的糖蛋白，研究表明糖基化不影响其生物学活性【18】。因此， 利用原核表达宿主制备的重组hscf具有与天然hscf相一致的生物学活性, 这为大规模制备具有生物学活性的rhscf

13、奠定了理论基础。研究发现rhscf在大肠杆菌中以包涵体形式表达，通过包涵体的分离 纯化，可以除去大量宿主蛋白和碎片，提高冃的蛋白在包涵体中的含量， 这对蛋白质的复性纯化比较有利。在本工艺中，复性采用常规的稀释复性， 复性蛋白经超滤浓缩，同时鉴于rhscf等电点为5.5左右，将超滤浓缩样 品调节ph为4.5上样于sp-sepharose ff层析柱除去大量杂蛋白，naci梯 度洗脱即可得到较高纯度的rhscfo由于sp-sepharose ff层析柱不能除去 二聚体和异构体，仍需要进一步精细纯化。在酸性条件下，rhscf相对稳 定，于是本工艺中在ph 2.5条件下采用source 30rpc反相

14、柱，利用乙醇梯 度洗脱能有效去除二聚体和异构体。乙醇梯度洗脱条件温和，成本低，回 收率高。最后，利用qsepharose ff层析柱有效去除乙醇，得到纯度为98% 以上、具有生物学活性的rhscf,并且各项检测指标均符合要求。研究表 明，本工艺从小试到连续3批中试放大中的发酵、样品制备以及各项指标 检测均非常稳定，并且设计的工艺条件操作简单易行。动物体内试验表明 其具有较强的外周血干/祖细胞动员能力【19】，表明建立的大规模制备 rhscf牛产工艺符合大规模牛产的要求。rhscf是一种有重要应用前景的细胞因子,rhscf具有多种生物医学功 能以及对造血细胞的作用。在成功构建的rhscf工程菌基

15、础上，经发酵进 而建立了一种大规模制备rhscf的分离纯化工艺，为rhscf的开发应用奠定基础， rhscf的应用领域将会不断拓宽。参考文献【llbmudy vc.stem cell factor and hematopoiesis.bood?1997,90:1345 1364【2】吴军、巩新、唱韶红、赵志虎、左从林、马清钧study of recombinant stem cell factor期刊论文卜生物工程学报2003(06)3 lee sj.yoon jh.song ks chrysin inhibited stem cell factor (scf)/c-kit complex-i

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