实验六：高效液相色谱法用于有机农药残留的分离与定量分析

1、实验六：高效液相色谱法用于有机农药残留的分离与定量分析学生：请叫我红领巾 一、实验目的：1、 应用高效液相色谱法对磺胺类抗生素的定性和定量检测2、学习谱图和数据的处理方法二、实验原理：磺胺族抗生素包括磺胺嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺甲噁唑，等, 被广泛应用到水产、畜禽类养殖中。它们被添加到动物饲料中, 以促进动物的生长以及防治各种疾病, 如果不能严格控制停药期, 很容易造成在动物肉和组织中残留, 给人体健康带来危害, 因此世界各国对畜禽肉中的磺胺族残留都有严格的限量要求。GB/T 5009.116- 2003 用液相色谱法检测畜禽肉中的磺胺类药物残留量, 操作简单快速,但是该方法灵敏度比较低。三、

2、实验仪器与试剂：仪器：岛津液相色谱仪，SPD-20A检测器，LC-20AT泵，微量进样器，C18色谱柱试剂：磺胺嘧啶标准溶液，磺胺吡啶标准溶液，磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合液（1：1），乙腈（AR），0.05%甲酸溶液样品的配制：0.05%甲酸溶液：取0.25ml的甲酸标准溶液用去离子水定容至500ml的容量瓶中。磺胺嘧啶标准溶液与磺胺吡啶标准溶液：分别称取0.10g的磺胺嘧啶、磺胺吡啶用甲醇定容至100.0 mL，用0.45µm滤膜过滤（先在一次性注射器加上0.45µm滤膜，然后把活塞杆拉出来，把要过滤的溶液倒进去再把杆推进滤出溶液。）得到磺胺嘧啶和磺胺吡啶的分别为1 

3、;mg/mL（1000ppm）。分别吸取磺胺嘧啶和磺胺吡啶标准溶液各5mL，置于10 mL容量瓶中磺胺吡啶和磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合0.5 mg/mL（500ppm）四、实验步骤：1、准备1.1准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜过滤，超声脱气20min。（这里用的是流动相是乙腈(B)和0.05%甲酸溶液(A)，分别用有机相系和水相系的0.45µm滤膜过滤，超声脱气20min。）1.2根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。1.3配制样品浓度为1000ppm（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45m滤膜过滤。（即分别称取0.10g的磺胺嘧啶、磺胺吡啶用甲

4、醇定容至100.0 mL，用0.45µm滤膜过滤（先在一次性注射器加上0.45µm滤膜，然后把活塞杆拉出来，把要过滤的溶液倒进去再把杆推进滤出溶液。）得到磺胺嘧啶和磺胺吡啶的分别为1 mg/mL（1000ppm）。分别吸取磺胺嘧啶和磺胺吡啶标准溶液各5mL，置于10 mL容量瓶中磺胺吡啶和磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合0.5 mg/mL（500ppm）。 1.4检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。2、开机接通电源，依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站（即电脑桌面上的CS

5、-Light Real Time Analysis）。3、参数设定3.1波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按func键接着按Enter键，用数字键输入所需波长值281nm，按Enter键确认。按CE键退出到初始屏幕。 , w43.2流速设定：在A泵显示初始屏幕时，按func键，用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过1.0 mL/min），按Enter键确认。按CE键退出。3.3流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按conc键，用数字键输入流动相B乙腈的浓度百分数(20%)，按Enter键确认。按CE键退出。 4、更换流动相并排气泡4.1将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液

6、瓶中；4.2逆时针转动A/B泵的排液阀180°，打开排液阀；4.3按A/B泵的purge键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止；4.4将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。4.5如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。4.6如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设流速为5ml/min，按pump键，冲洗3min后再按pump键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。 5、平衡系统5.1按N2000色谱数据工作站操作规程打开"在线色谱工作站"软件，输入实验信息并设定各项方法参数后，按下&qu

7、ot;数据收集"页的 查看基线 按钮。5.2等度洗脱方式 ; g5 J; Q5.2.1按A泵的pump键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。按A泵的pump键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。5.2.2检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。5.2.3观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按4.6操作。5.2.4观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声为<0.001

8、mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。6、进样6.1进样前在CS-Light Real Time Analysis中:(1)点击“单次分析”，接着点击“样品记录”，在样品记录名称中输入所要检测得样品名称，然后点击“数据文件”选择该样品储存在哪里，最后在“数据储存的文件夹”后面输入该样品名称，点击确定。(2)在信号采集菜单中设定停止时间和延迟时间。6.2进样前按检测器zero键调零，按软件中 零点校正 按钮校正基线零点，再按一下 查看基线 按钮使其弹起。6.3用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取20 mL。7、数据处理7.1在桌面双击“CS-Light Postrum Analysis”

9、，点击确定按钮后，在“文件夹目录中”选中该样品记录双击鼠标，在谱图上单击鼠标右键的“显示设置”，在“显示设置”中选择“展开色谱”的“时间”“0”到“20”后点击确定7.2用鼠标点击“编辑”选择“积分”中的“最小峰面积/高”输入“最小峰面积值”，然后又点击“定量”在“定量方法”中选择“面积归一法”，然后点击查看。7.3复制谱图到Word文档，在谱图中点击鼠标右键选择“复制”；复制数据，单击鼠标左键全选，然后鼠标右键“复制表格到剪贴板（b）”。8、关闭仪器分析完毕后，关闭色谱工作站，再自上而下关闭仪器。五、实验结果与数据分析图一：磺胺嘧啶表一：磺胺嘧啶峰号组分名保留时间面积面积%峰高浓度理论塔板1

10、磺胺嘧啶9.5535688838.1100.000304837.70.000006354.168图二：磺胺吡啶表二：磺胺吡啶峰号组分名保留时间面积面积%峰高理论塔板1磺胺吡啶10.9014904984.3100.0000248805.97437.090图三：混合样表三：混合样峰号组分名保留时间面积面积%峰高理论塔板分离度1磺胺嘧啶9.5203012502.054.6541160770.06388.862-2磺胺吡啶10.8992499441.845.3459126259.77329.3892.806数据比较以基线为准：最高为磺胺嘧啶；中间为磺胺吡啶；下面为混合样结果分析：本实验所检测样品为已知样品磺胺嘧啶、磺胺吡啶标准溶液及磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合液，实验中采用进一单一标准样品，得到其谱图后再对混合样品液进行检测，根据保留时间做定性分析，从而确定另一待测物的谱峰。在定性分析后，由于本实验中待测物只有两种，且样品液能保证待测物均能出峰，故定量分析采用简便，准确，操作条件对结果影响较小面积归一化法 1.定性分析：实验中磺胺嘧啶的保留时间为9.553min，磺胺嘧啶的保留时间则为10.901min，而混合样中的峰一保留时间为9.520min，峰二的保留时间为10.899min，所以可认为混合样中峰一位磺胺嘧啶峰，峰二为磺胺吡啶峰。2.分离效果：实验测得混合样中磺