第七章细胞融合及应用

1、第七章第七章 细胞融合与应用细胞融合与应用第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述细胞融合（细胞融合（cell fusion)cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合的定义一、细胞融合的定义umuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uvirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uluginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。ulange于1875年第一个观察到脊椎动物

2、（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。ucienkawski(1876)、buck(1877)、geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田（okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（peg）化学融合法。u1975年kohler和milstein成功地融合了小鼠b-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究历史二、细胞融合研究历史几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比植物融合细胞成长状态对比, ,右瓶为地面

3、融合的右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 动物细胞融合实验使用的小白鼠 三、动植物细胞的融合过程三、动植物细胞的融合过程植植物物细细胞胞融融合合过过程程人人造造小小鼠鼠培培育育过过程程示示意意图图四、细胞融合的意义四、细胞融合的意义u理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体dna亦可

4、发生重组，从而产生新的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。第二节第二节 细胞融合的基本原理细胞融合的基本原理显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解第三节第三节 细胞融合的常用方法细胞融合的常用方法一、仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要ca2+和mg2+，最适ph为8.0一

5、8.2；细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需ca2+和atp；融合成巨大细胞，仍需atp 。病毒法的主要步骤病毒法的主要步骤1. 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；2. 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；3. 两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；4. 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 u聚乙二醇(peg)结构为：hoh2c（ch20ch2）nch2oh，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。upeg浓度以w/w；如将

6、10克peg与10mleagle氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50peg溶液。upeg经高压灭菌后，与温热的engle氏液混合。u通常用分子量低于1000的peg作融合剂最好，50peg溶液能产生 最多杂交细胞。upeg溶液在ph6.0时细胞融合率最高。 u优点是易得，用法简单，融合效果稳定。二、聚乙二醇（二、聚乙二醇（peg）法）法聚乙二醇（聚乙二醇（peg）法细胞融合过程）法细胞融合过程peg的作用机理： kao等认为，由于peg分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成h键，从而在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融

7、合；另外，peg能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。 peg诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，peg可能对细胞有毒害。 （1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50peg溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至 5ml，37的co2培养箱中培养。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。聚乙二醇（聚乙二醇（peg）法细胞融

8、合步骤）法细胞融合步骤pegpeg诱导的细胞融合过程示意图诱导的细胞融合过程示意图 三、电融合法三、电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：电融合法的优点：u融合率高、重复性强、对细胞伤害小；u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；u免去peg诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极

9、子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 电融合法的基本过程电融合法的基本过程电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图第三节第三节 杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：以下几种类型：u异核细胞：非同源细胞的融合体。u同核细胞：两个相同细胞的融合体。u多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感

10、型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法常用的杂种细胞筛选方法一、何谓单克隆抗体？一、何谓单克隆抗体？应用应用1 1：细胞杂交瘤技术与单克隆抗体：细胞杂交瘤技术与单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。t淋巴细胞淋巴细胞：即胸腺依赖淋巴细胞（thymus dependent lymphocyte）。亦可简称t细胞。来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。目前认为，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前t细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的t细胞。成

11、熟的t细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。t细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。t细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。人类免疫系统的介绍人类免疫系统的介绍 外分泌淋巴系统：呼吸道和生殖泌尿系统外分泌淋巴系统：呼吸道和生殖泌尿系统内分泌淋巴系统：胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结等内分泌淋巴系统：胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结等b淋巴细胞淋巴细胞：来源于骨髓的多能干细胞。在禽类是在法氏囊内发育生成，故又称囊

12、依赖淋巴细胞（bursa dependent lymphocyte）/骨髓依赖性淋巴细胞简称b细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与t淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。成熟的b细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。b细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较t细胞多，在血液和淋巴结中的数量比t细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。b细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受

13、体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。b1细胞为t细胞非依赖性细胞。b2为t细胞依赖性细胞。b细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存在。 b细胞淋巴瘤是一种最常见的淋巴细胞白血病，有关这种疾病的研究不断涌现。 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫刺激的b淋巴细胞(antigen stimulated b lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有b淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridom

14、a technology ）。niels k. jerne g. kohler c. milstein 免疫网络学说免疫网络学说单克隆抗体：单克隆抗体：1984 nobel二、杂交瘤技术的基本原理二、杂交瘤技术的基本原理三、杂交瘤细胞的制备三、杂交瘤细胞的制备（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（hgprt-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（tk-）hat培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，h）氨基喋呤（am

15、inopterin， a）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， t）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（hgprt-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（tk-）（二）免疫小鼠（二）免疫小鼠 免疫程序是取68周龄balbc雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，35天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以igg为例，第一次为l00 g，第二次为50 g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。（三）脾细胞的制

16、备（三）脾细胞的制备(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次；(3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中；(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；(5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中置5分钟；(6)离心(800一1000转分)计数、备用。（四）细胞准备（四）细胞准备（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37)

17、，计数活力细胞(不少于90)；（2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37)，并计细胞数和测定活力细胞；（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。（五）细胞融合（五）细胞融合(1)将1ml 40的peg液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等体积细

18、胞悬液，向另一96孔板中加50p1；(7)送入5co2，温箱中37培养，24小时后更换成hat选择性培养掖。（六）融合后细胞培养（六）融合后细胞培养(1)融合后710天用hat培养液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔23天半量换液一次；(2)两周后可改用ha培养液半量换液，或仍用hat培养液；(3)23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；(4)待集落增殖生长至13孔时，应进行抗体检测。hat培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，h）氨基喋呤（aminopterin， a）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， t）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖

19、激酶缺陷型（hgprt-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（tk-）（七）抗体检测（七）抗体检测免疫荧光试验放射免疫试验(ria)联免疫吸附试验(elisa)（八）单克隆抗体的大量制备（八）单克隆抗体的大量制备体内接种法体内接种法体外培养法体外培养法血清法血清法腹水法腹水法传统培养法传统培养法生物反应器培养法生物反应器培养法四、单克隆抗体的应用四、单克隆抗体的应用单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成 本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不 断发展。 五、五、 人源单克隆抗体人源单克隆抗体为什么制备人源单克隆抗