降解难降解物质基程菌的构建和运用

1、清华清华大大学环学环境境学学院院降解难降解污染物的基因工程菌降解难降解污染物的基因工程菌 构建与应用进展构建与应用进展小组成员：侯德林、敖秀玮、范征、小组成员：侯德林、敖秀玮、范征、 杨珏婕、刘灿杨珏婕、刘灿现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告难降解物质和生物降解技术难降解物质和生物降解技术目录目录1基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法2 案例一：能降解甲案例一：能降解甲苯苯和和六价六价铬铬的耐的耐辐辐射工程菌射工程菌 3案例二：活性污泥法中基因工程菌案例二：活性污泥法中基因工程菌处理含镍电镀废水处理含镍电镀废水45总结与展望总结与展望现现代代环环境生物境生物学课学课程程报

2、报告告chapter1难难降解物降解物质质和生物降解技和生物降解技术术难降解物质难降解物质定义：定义：难降解物质是指被微生物分解时速度很慢，分解不彻底的物质。分类：分类：有机物（多环芳烃、卤代烃、杂环类化合物、有机氰化物、有机磷农药、表面活性剂、有机染料等），无机物（重金属汞、铬等）。特点：特点：有急性或慢性毒性，大多数具有三致作用，复杂有机物多含苯环杂环结构。生物降解技术生物降解技术定义：定义：生物降解是指利用生物分泌的酶，通过加氢、脱氢、氧 化、还原、水解、脱卤等生化反应，将复杂的有机化合物分解为无机物或简单有机物，或是转变无机物如重金属的存在形式从而降低毒性的过程。现现代代环环境生物境生

3、物学课学课程程报报告告chapter1难难降解物降解物质质和生物降解技和生物降解技术术生物降解技术生物降解技术传统技术厌氧水解酸化、反硝化、共代谢和人工湿地等。基因工程菌技术基因工程菌技术定义定义：将携带有特殊性状的目的基因导入细菌内并表达，产生 人预期的产物，使细菌具有新的遗传性状或提高原来的性状，这种按人预定的意向选育出的优良菌株称为基因工程菌。要求要求：除较高降解能力外，还要具有耐药性、抗毒性、营养条件简单、生理代谢稳定、生长繁殖迅速等。keykey：找到能够降解难降解物质的菌株，找到降解难降解物质的酶，找到合成这些酶的基因。现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告chapter2基

4、因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法基因工程菌的基因工程菌的构构建原理建原理1.优化污染物降解途径2.提高污染物生物可利用性3.增强细菌的环境适应性现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告chapter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法重组互补代谢途径重组互补代谢途径降解基因重组，将分属于不同不同细菌个体中的污染物代谢途径组合组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌。改变污染物代谢产物流向改变污染物代谢产物流向抑制性中间产物抑制性中间产物不生成或尽快转化，从而提高污染物降解效率。 同源基因体外随机拼接同源基因体外随机拼接短时问内筛选短时问内筛选出所需要的dna重

5、组蛋白可以运用于污染物降解基因的重组。1.优化污染物降解途径现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告chapter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法重组表面活性剂编码基因重组表面活性剂编码基因生物表面活性剂生物表面活性剂改善疏水化合物的水溶性水溶性和表面张力表面张力，提高生物可利用性；利用基因工程的手段来重组表面活性剂的编码基因。重组污染物跨膜转运基因重组污染物跨膜转运基因提高污染物的摄取速度提高污染物的摄取速度有助于提高污染物的降解速度；e.g许多芳香烃类化台物进入降解细菌内部需要依靠细胞膜上的透性酶载体蛋白透性酶载体蛋白。2.提高污染物生物可利用性现现代代环环境生物境生

6、物学课学课程程报报告告chapter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法增强细菌的抗毒能力增强细菌的抗毒能力芳香烃类污染物高度疏水性，易在细菌细胞膜脂质层积累，产生毒性；增加细胞内磷脂合成，细胞膜表面的脂多糖结构改性等耐耐受机制受机制促使细菌在高浓度芳香烃类污染环境下得以生存。增强细菌的放射线耐受性增强细菌的放射线耐受性使基因在不发生突变的前提下可完整地表达，无致病性无致病性，易分离培养等，可用于放射性环境可用于放射性环境下进行生物修复的细菌。3.增强细菌的环境适应性现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告chapter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法基因工

7、程菌的基因工程菌的构构建方法建方法细胞融合质粒转移一般方法现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告chapter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法1. 构建的一般方法目的基因片段的分离目的基因的克隆和表达目的基因的克隆和表达现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告chapter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法生物法：病毒融合法。化学法：包括盐类融合法、高钙和高ph值融合法、聚乙二醇融合法。物理法：电脉冲诱导细胞融合技术、激光融合技术、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术。2.细胞融合现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告cha

8、pter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法2.细胞融合序号融合方法融合途径参见文献备注1仙台病毒（sev）诱导细胞脂类双分子层结构改变zhang q4张海凤 5体内外应用完全，但病毒制备困难、操作复杂、实验重复性低、融合率低、价格昂贵。2水疱性口炎病毒（vsv）诱导vsv融合蛋白g蛋白（vsv-g）在ph6时被可逆性激活杨俊兴6无毒，简便，但可引起某些宿主免疫性反应，融合效率有待研究。3聚乙二醇（peg）诱导原生质体粘连，质膜结构重排lentz br7无种属特异性或专一性，成本低，融合率高，细胞损伤大，效率依赖经验。chapter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方

9、法插入失活法组织化学法正向选择法3.质粒转移现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告chapter2基因工程菌基因工程菌构构建原理和方法建原理和方法3.质粒转移序号质粒鉴定方法参见文献备注1pbr322插入失活法张翠英11挑选在氨苄青霉素培养基上生长而在四环素培养基上不长的菌落。2prsv-lacz和prsvth组织化学法郑少鹏12能表达lacz的细胞，采用x-gal组织化学法染成蓝色，能表达th基因的细胞采用免疫组织化学abc法染成浅棕色。3pmclac iv/neo正向选择法姚真真13通过培养基中碳源来控制菌落生长，进而正向选择lac iv靶

10、基因突变子。案例一：能降解甲苯和六价铬的耐辐射工程菌案例一：能降解甲苯和六价铬的耐辐射工程菌 背景：背景：美国能源部废物处置点的土壤和包气带中有很多有机、无机和放射性污染物。这些污染物大部分是由于过去对废弃物的直接丢弃和简易挖坑填埋造成的，也有部分是由于废物填埋场的垃圾滤液渗漏所造成的。这些地方的土壤大多数都含有：放射性污染物放射性污染物，如铀、锶和铯；重金属重金属，如铬、铅和汞；还有石油烃类石油烃类、甲苯、乙苯和二甲苯类有机污染物和多氯联苯。 现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告金金属氧属氧化化还还原原有机物有机物降解降解影响降解污染物影响降解污染物细菌的活性细菌的活性 长期的长期的

11、慢性电慢性电离辐射离辐射 需要具有耐辐射需要具有耐辐射的工程菌的工程菌 现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告deinococcus radiodurans strain r1 (atcc baa-816)（耐辐射球菌）是deinococcus细菌中以抗辐射为特点的一种细菌。这是一种非病原菌，能够进行基因工程的改造，而且之前的研究表明它对于伽马射线有非常好的抗性。在复杂的营养状况中，这种细菌也能生长、繁殖和进行功能表达。这些特点促进了对其基因组序列和功能的研究，蛋白组和转录组分析和以及对生物修复的发展。 pseudomonas putida strains f1pseudomonas p

12、utida strains f1和和mt-mt-2 2（恶恶臭假臭假单单胞菌）胞菌） tod和xyl基因能降解甲苯甲苯的代谢途径共有5 种,但都是先通过甲苯单加氧酶或双加氧酶形成邻苯二酚这个关键中间产物, 然后通过邻位切割或间位切割开环。p. putida在有氧条件下，的代谢途径如图1a 现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告todtod基因能基因能转转化甲化甲苯为苯为2-hydroxy- 2-hydroxy- 6-oxo-2,4-6-oxo-2,4-heptadienoate heptadienoate xylxyl基因基因将将中中间产间产物最物最终转终转化化为为醋酸、丙醋酸、丙酮酮酸

13、酸 和和乙酰乙酰辅酶辅酶a a 现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告结果：（结果：（1）r1工程菌工程菌tod 和和 xyl基因的功能表达基因的功能表达 现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告有辐射的情况下p. putida f1（恶臭假单胞菌）同化甲苯的能力降低了96% ；md884增加了60% （2）md884工程菌的生长特性工程菌的生长特性fig 3表明在255m浓度的甲苯中，大约15小时50%的甲苯被降解，这个浓度与美国能源部报道的垃圾填埋场的甲苯浓度相当。 现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告（3）md884工程菌降解六价铬的功能工程菌降解六价铬的功能 在甲苯存

14、在的情况下原生r1菌对六价铬的降解能力受到了抑制，而基因工程菌md884在甲苯存在的情况下同时能降解六价铬，培养14天后，六价铬的浓度下降了54% 现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告案例二：基因工程菌案例二：基因工程菌活性污泥法处理含镍电镀废水活性污泥法处理含镍电镀废水背景：背景： 电镀镍生产清洗过程中产生的废水往往含有过量的镍，对人类健康有很大影响。 用于处理含镍废水的方法中，生物吸附法较于其他物理化学方法在反应速度和运行成本等方面更有优势。但是也存在对环境因素敏感、选择性差等不足，希望通过基因工程技术的引入解决这些问题。 目前国内外利用基因工程菌处理重金属废水还处于实验室研究阶段

15、，距离实际工程应用有一定差距。基因工程菌在吸附机理和工程应用的影响因素等方面的研究还有待进一步开展。现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告镍钴转运酶是微生物中存在的一类重要的镍转运酶，由八螺旋结构组成，是一段跨膜区域的保守序列。大多数镍钴转运酶由基因组序列编码。张迎明等人克隆表达了金黄色葡萄球菌的镍钴转运酶基因，并研究其在大肠杆菌中的表达条件。并将构建得到的重组菌e.coli bl21与活性污泥联合用于处理电镀废水，取得了较好的效果现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告研究路线：研究路线：现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告性能测试：性能测试：atcc6538镍钴转运酶ni

16、cot对镍离子的吸附特异性比较高，且吸附容量比较大。基因工程菌在ph值为4-9的范围内都有比较好的吸附效果基因工程菌转接10、20、30、40、50次，重组质粒保持良好的结构稳定性。工程菌对镍的富集能力也具有较好的稳定性，平衡富集量均达到8.02mg/g以上，溶液中镍的去除率超过90.24%.现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告处理实际废水的应用：处理实际废水的应用：菌株：本实验所构建的表达atcc6538镍钴转运酶nicot基因的重组菌e.colibl21活性污泥：采自广州市猎德污水处理厂，离心后使用，含水率为82.5%废水：广东省阳江市某电镀厂两个不同车间现现代代环环境生物境生物学

17、课学课程程报报告告处理效果：处理效果：当活性污泥单独投加时，对电镀废水中镍的去除效果并不明显：污泥浓度为5g/l时，对两种废水水样中镍去除率仅为7.31%和10.62%。采用基因工程菌-活性污泥曝气处理电镀废水取得了较好的效果。现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告基因工程菌-活性污泥联用处理电镀废水时，在ph值为3-7的范围内，电镀废水中的总镍去除效果较好：两种电镀废水的去除率分别达到75.42%和83.47%以上。基因工程菌-活性污泥联用对废水中总镍的吸附速率比较快，在振荡吸附30min后，两种电镀废水的总镍去除率分别达到了70.52%和75.34%，完成了总去除率的80%以上现现代代环环境生物境生物学课学课程程报报告告总结与展望总结与展望（1）降解难降解物质的技术在日益进步，由最初利用微生物共同降解发展到如今