蛋白质的研究进展

1、蛋白质组学研究进展蛋白质组学研究进展一、蛋白质组学的一、蛋白质组学的产生与发展产生与发展二、蛋白质组学的相关概念二、蛋白质组学的相关概念三、蛋白质组学研究方法概述三、蛋白质组学研究方法概述四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 1986年，年，达尔贝科达尔贝科提出人类基因组计划提出人类基因组计划 1990年，美国国会批准年，美国国会批准“HGP”，9月，月，中国中国获准获准加入，负责测定人类基因组序列的加入，负责测定人类基因组序列的1% 2000年年6月月26日，草图绘制成功日，草图绘制成功 2003年年4月月14日，人类基因组序列图绘制成功日，人类基因组序列图绘制成

2、功改变花色的转基因矮牵牛花改变花色的转基因矮牵牛花转入荧光素酶蛋白基因的发转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草荧光烟草蓝色玫瑰蓝色玫瑰 19941994年，澳大利亚科学家年，澳大利亚科学家WilkinsWilkins等人首次提出蛋白质组概念等人首次提出蛋白质组概念 19961996年，澳大利亚建立了第年，澳大利亚建立了第1 1个蛋白质组研究中心（个蛋白质组研究中心（APAFAPAF） 20012001年年4 4月，美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（月，美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（HUPOHUPO） 2020世纪世纪9090年代中期年代中期 ，蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在，蛋白质组学

3、以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象及其活动方式为研究对象各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：n 美国国家癌症研究院美国国家癌症研究院（National Cancer National Cancer InstituteInstitute）和）和食品药品监督管理局（食品药品监督管理局（Food and Food and Drug AdministrationDrug Administration）共同投资数百万美元建共同投资数百万美元建立立癌症不同阶段的蛋白质组数据库癌症不同阶段的蛋白质组数据库。n CeleraCelera公司投资上亿美

4、元独自启动了全面鉴公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。工作。n我国也于我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会学研讨会 n2003成立了中国人类蛋白质组组织（成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），），并分别于并分别于2003年年9月、月、2004年年8月以及月以及2005年年8月月召开了

5、中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，会，2004年年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。质组学会议。n科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计计划项目和划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员计划项目；国家自然科学基金委员会也将会也将“蛋白质组研究蛋白质组研究”列为重点项目。列为重点项目。n2003年年12月月15日，国际人类蛋白质组组织负责人在北京宣布，日，国际人类蛋白质组组织负责人在北京宣布，国际人类蛋白质组计划正式启动，国际人类蛋白质组计划正式

6、启动，“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”和和“人类血浆蛋白质组计划人类血浆蛋白质组计划”两大项目首先开始执行，其中两大项目首先开始执行，其中“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”由中国科学家领导执行，这是我国由中国科学家领导执行，这是我国科学家第一次领导执行重大国际科技协作计划。科学家第一次领导执行重大国际科技协作计划。 n首次由我国科学家领导的国际重大科研合作项目首次由我国科学家领导的国际重大科研合作项目人类肝人类肝脏蛋白质组计划，被宣告取得阶段性新进展。几年来围绕人类脏蛋白质组计划，被宣告取得阶段性新进展。几年来围绕人类肝脏蛋白质组的肝脏蛋白质组的表达谱、修饰谱及其相互作用

7、的连锁图表达谱、修饰谱及其相互作用的连锁图等九大等九大科研任务，我国科学家已经成功测定出科研任务，我国科学家已经成功测定出6788个个高可信度的中国高可信度的中国成人肝脏蛋白质，系统构建了国际上第一张人类器官蛋白质组成人肝脏蛋白质，系统构建了国际上第一张人类器官蛋白质组“蓝图蓝图”；发现了包含；发现了包含1000余个余个“蛋白质蛋白质-蛋白质蛋白质”相互作用的相互作用的网络图；建立了网络图；建立了2000余株蛋白质抗体。余株蛋白质抗体。蛋白质组学研究进展蛋白质组学研究进展一、蛋白质组学的产生与发展一、蛋白质组学的产生与发展二、蛋白质组学的二、蛋白质组学的相关概念相关概念三、蛋白质组学研究方法概

8、述三、蛋白质组学研究方法概述四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用蛋白质组是澳大利亚学者蛋白质组是澳大利亚学者WilliamsWilliams和和WilkinsWilkins于于19941994年首先提出，源于蛋白年首先提出，源于蛋白质（质（proteinprotein）与基因组（）与基因组（genomegenome）两）两个词的杂合个词的杂合, ,意指意指proteins expressed proteins expressed by a genomeby a genome，即，即“一个细胞或一个组一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质织的基因组所表达的全部蛋

9、白质”。 蛋白质组学的概念蛋白质组学的概念对应于基因组的所有蛋白质构成的对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白整体，不是局限于一个或几个蛋白质。质。 同一基因组在不同细胞、不同组织同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同中的表达情况各不相同 。在空间和时间上动态变化着的整体。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组是：蛋白质组是： 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化动态变化的的蛋白质组成蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态成份、表达水平

10、与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 n了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；n明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；n描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。如与药物结合并且决定其活性的部位。蛋白质组学研究进展蛋白质组学研究进展一、蛋白质一、蛋白质组学的产生与发展组学的产生与发

11、展二、蛋白质组学的相关概念二、蛋白质组学的相关概念三、蛋白质组学三、蛋白质组学研究方法概述研究方法概述四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质组研究更为复杂和困难：n 蛋白质数目大大超过基因数目蛋白质数目大大超过基因数目n 蛋白质随时间和空间而变化蛋白质随时间和空间而变化 当前主要任务：当前主要任务：发展发展高通量、高灵敏度、高准确性高通量、高灵敏度、高准确性的研的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。蛋白质组学研究中的主要任务。蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、

12、一、蛋白质组表达模式蛋白质组表达模式的研究方法的研究方法n蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备n蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离n蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组研究中的样品分析鉴定n蛋白质组学研究的生物信息学蛋白质组学研究的生物信息学n定量蛋白质组学研究定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法二、蛋白质组功能模式的研究方法n蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质翻译后修饰的研究n蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术研究蛋白质组的研究蛋白质组的组成成分组成成分 支撑技术主要有支撑技术主要有双向凝胶电泳双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术以质谱为代表的

13、蛋白质鉴定技术及及生物信息学分析生物信息学分析。 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法一、蛋白质组表达模式的研究方法n蛋白质组研究中的蛋白质组研究中的样品制备样品制备n蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离n蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组研究中的样品分析鉴定n蛋白质组学研究的生物信息学蛋白质组学研究的生物信息学n定量蛋白质组学研究定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法二、蛋白质组功能模式的研究方法n蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质翻译后修饰的研究n蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 通常可采用通常可采用细胞或组织细胞或组织中

14、的全蛋白质组分进中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。行蛋白质组分析。 也可以进行也可以进行样品预分级样品预分级，即将细胞或组织中，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。 样品预分级的主要方法样品预分级的主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度测灵敏

15、度。临床样本都是由多种细胞或组织混合而成，如肿瘤临床样本都是由多种细胞或组织混合而成，如肿瘤中癌变上皮细胞总是与血管、间质细胞等混杂一起。中癌变上皮细胞总是与血管、间质细胞等混杂一起。 激光捕获显微切割激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM)可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。定的细胞或细胞群。 LCM具有其独特的优点具有其独特的优点n快速简单、有效减少交叉污染。快速简单、有效减少交叉污染。n样品的切割与分离由激光一步完成，并可以保持被分离的样品的切割与分离由激光一步完成，并可以保持被分离的

16、样品的完整性。样品的完整性。n结合免疫荧光能够基于组织细胞的表型和功能特征进行分结合免疫荧光能够基于组织细胞的表型和功能特征进行分离样品组分。离样品组分。n对制样的要求灵活多样，使用范围较广。对制样的要求灵活多样，使用范围较广。 通过通过LCM对组织切片进行切割与分离可以分离收集从形态对组织切片进行切割与分离可以分离收集从形态上（普通染色），表型或功能上（荧光染色）可以辨认均一性上（普通染色），表型或功能上（荧光染色）可以辨认均一性的细胞群体，从而的细胞群体，从而克服了组织不均一克服了组织不均一的特点，提高了数据的准的特点，提高了数据的准确性和可靠性，这在肿瘤生物学研究中具有广泛应用。确性和可

17、靠性，这在肿瘤生物学研究中具有广泛应用。 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法一、蛋白质组表达模式的研究方法n蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备n蛋白质组研究中的蛋白质组研究中的样品分离样品分离n蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组研究中的样品分析鉴定n蛋白质组学研究的生物信息学蛋白质组学研究的生物信息学n定量蛋白质组学研究定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法二、蛋白质组功能模式的研究方法n蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质翻译后修饰的研究n蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(two-dimensio

18、nal electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的：利用蛋白质的等电点和分子量等电点和分子量，结合凝胶化，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。学特性，分离各种蛋白质的方法。第第1向基于蛋白质的向基于蛋白质的等电点不同等电点不同用用等电聚焦分离等电聚焦分离，具有，具有相同等电点的蛋白质无论其分子大小，在电场的作用下都相同等电点的蛋白质无论其分子大小，在电场的作用下都会用聚焦在某一特定位置即等电点处；第会用聚焦在某一特定位置即等电点处；第2向则按向则按分子量的分子量的不同不同用用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。二

19、维平面上分开。第一向分离第一向分离等电聚焦等电聚焦蛋白质是两性分子，在不同的蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值值即该即该蛋白质的等电点蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动

20、的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。位点。第二向分离第二向分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳的第二向是将

21、双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDSPAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第大小与第一相垂直的分离。一相垂直的分离。蛋白质与十二烷基硫酸钠蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质结合形成带负电荷的蛋白质SDS复合复合物，由于物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂所带的负电荷远远超过蛋白质是一种强阴离子去垢剂所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中

22、电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响而主要取决于蛋白凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响而主要取决于蛋白质分子的质量大小质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系，在蛋白质，其迁移率与分子量的对数呈线性关系，在蛋白质组研究中。需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间组研究中。需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要的比较十分重要可分离可分离10100 kD分子量的蛋白质分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配与质谱分析匹配 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-DE)技术的缺

23、点技术的缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。联用实现自动化。 u 液相色谱法液相色谱法 liquid chromatography，LCu毛细管电泳法毛细管电泳法 capillary electrophoresis，CEu液相色谱液相色谱- -质谱联用技术（质谱联用技术（L LPLPLC-MS/MSC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过蛋白质混合物直

24、接通过液相色谱分离液相色谱分离以代替以代替2-DE的的分离，然后进入分离，然后进入MS系统系统获得获得肽段分子量肽段分子量，再通过，再通过串联串联MS技术技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。定蛋白质。 根据蛋白根据蛋白质质带电性及疏水性带电性及疏水性不同，用不同，用MS分离多肽复合物。分离多肽复合物。离子交换色谱离子交换色谱是通过溶质在离子交换色谱固定相上具有不同是通过溶质在离子交换色谱固定相上具有不同的保留能力，而实现样品分离的色谱技术，而的保留能力，而实现样品分离的色谱技术，而反相液相色谱反相液相色谱是基于是基于溶质疏水

25、性的差异溶质疏水性的差异而实现分离的色谱技术。通过这两而实现分离的色谱技术。通过这两种色谱模式的联用，可以实现对种色谱模式的联用，可以实现对复杂生物样品的二维分离。复杂生物样品的二维分离。 u多维多维色谱技术（色谱技术（LC/LC-MS/MS） u多维蛋白质鉴定技术多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology) 将不同分离模式的将不同分离模式的色谱柱以串联方式合并于同一根色谱柱中进行，在同一根色谱色谱柱以串联方式合并于同一根色谱柱中进行，在同一根色谱柱的前半部分装填柱的前半部分装填强阳离子色谱填料强阳离子色谱填料，后部

26、分装填，后部分装填反相液相色反相液相色谱填料谱填料，该方法可对，该方法可对样品量较少的蛋白质进行快速分析样品量较少的蛋白质进行快速分析。 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法一、蛋白质组表达模式的研究方法n蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备n蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离n蛋白质组研究中的蛋白质组研究中的样品分析鉴定样品分析鉴定n蛋白质组学研究的生物信息学蛋白质组学研究的生物信息学n定量蛋白质组学研究定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法二、蛋白质组功能模式的研究方法n蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质翻译后修饰的研究n

27、蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术传统方法：传统方法：EdmanEdman降解法降解法: :EdmanEdman降解（降解（Edman degradationEdman degradation）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从是从蛋白质或多肽氨基末端蛋白质或多肽氨基末端进行分析。由埃德曼（进行分析。由埃德曼（P PEdmanEdman）在上世纪）在上世纪5050年代所创立。分为年代所创立。分为耦合、切割、萃取、转化、鉴定耦合、切割、萃取、转化、鉴定等几个步骤。首先在等几个步骤。首先在pH9.0pH9.0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯的碱性环境下

28、，将异硫氰酸苯酯(PhN=C=S(PhN=C=S，PITC)PITC)和蛋白质或多肽和蛋白质或多肽N N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)(TFA)处理耦合后产物，处理耦合后产物，将多肽或蛋白的将多肽或蛋白的N N一端第一个肽键选择性的切断，释放一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物；随后萃取出释放的氨基酸衍生物；随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(

29、PTH-(PTH-氨基酸氨基酸) )；最后；最后以色谱法鉴定出降解下来的以色谱法鉴定出降解下来的PTH-PTH-氨基酸种类，从而得到蛋白质或氨基酸种类，从而得到蛋白质或多肽多肽N N端端序列信息。序列信息。EdmanEdman降解法的优点是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应降解法的优点是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。产率和回收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。 一些传统蛋白质分析技术如蛋白质序列分析技术（一些传统蛋白质分析技术如蛋白质序列分析技术（Edman降解法降解法, 1950），仍然可用于当前蛋白质组研究），

30、仍然可用于当前蛋白质组研究。其缺点是难其缺点是难于实现高通量，同时对低丰度蛋白质的鉴定上其灵敏度难于达于实现高通量，同时对低丰度蛋白质的鉴定上其灵敏度难于达到要求到要求。 A-R-G-F-L-E-K-LA-R-G-F-L-E-K-L ( (得到部分序列得到部分序列) )491491蛋白质微蛋白质微量序列仪量序列仪印渍转移酶解提取肽混合物毛细管HPLC仪收集肽于PVDF膜 PVDF膜通过通过Edman降解对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线降解对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线 双向电泳分离新型蛋白质鉴定技术新型蛋白质鉴定技术 质谱（质谱（MSMS）法）法 基本原理基本原理：质谱法质谱

31、法(Mass Spectrometry,MS)(Mass Spectrometry,MS)即用电即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子分子相互作用产生的离子）子、亚稳离子、负离子和离子分子相互作用产生的离子）按它们的按它们的质荷比质荷比分离后进行检测的方法。分离后进行检测的方法。测出离子准确质量测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成即可确定离子的化合物组成。样品分子。样品分子离子化离子化后，根

32、据离子后，根据离子间间质荷比（质荷比（m/zm/z）的差异来分离并确定的差异来分离并确定样品的分子量样品的分子量。 MAIDI-TOFESI-MS/MS 酶解脱盐浓缩飞行时间质谱仪飞行时间质谱仪电喷雾串联质谱仪电喷雾串联质谱仪毛细管HPLC仪点样板序列标签(PST)数据库搜索数据库搜索双向电泳分离 蛋白质鉴定蛋白质鉴定通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线 肽肽质指纹（PMF）质谱技术鉴定蛋白质路线图质谱技术鉴定蛋白质路线图 基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser

33、desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）MALDI-TOF质谱仪：灵敏度高（可达质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小 电喷雾质谱电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）电喷雾质谱仪：灵敏度高）电喷雾质谱仪：灵敏度高,能与液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用能与液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用 主要质谱类型主要质谱

34、类型鉴定和注释蛋白质的路线鉴定和注释蛋白质的路线 基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱通过肽质谱指纹图通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配）和数据库搜寻匹配 电喷雾质谱电喷雾质谱通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配序列标签和数据库搜寻匹配 联合技术精确鉴定蛋白质联合技术精确鉴定蛋白质 组织切片或印片原位质谱分析技术组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋

35、共振质谱（傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS） 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法一、蛋白质组表达模式的研究方法n蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备n蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离n蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组研究中的样品分析鉴定n蛋白质组学研究的蛋白质组学研究的生物信息学生物信息学n定量蛋白质组学研究定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法二、蛋白质组功能模式的研究方法n蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质翻译后修饰的

36、研究n蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术应应 用用 1、对双向电泳结果进行图像分析，识别差异表、对双向电泳结果进行图像分析，识别差异表达的蛋白质斑点；构建双向凝胶电泳图谱。达的蛋白质斑点；构建双向凝胶电泳图谱。2、单独或综合运用质谱分析数据、氨基酸测序、单独或综合运用质谱分析数据、氨基酸测序结果等查询数据库以鉴定蛋白质。结果等查询数据库以鉴定蛋白质。3、构建蛋白质组数据库。、构建蛋白质组数据库。蛋白质组数据库是蛋白质组蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础研究水平的标志和基础 u瑞士的瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据

37、库。（多的蛋白质组数据库。（http:/www.expasy.ch/）u目前应用最普遍的数据库是目前应用最普遍的数据库是NRDB 和和dbEST数据库。数据库。uNRDB是由是由NCBI创建的，是创建的，是NCBI的的BLAST搜索程搜索程序的默认蛋白质序列数据库。该数据库由序的默认蛋白质序列数据库。该数据库由GenPept（由（由GenBank 编码序列自动翻译而成数据库）、编码序列自动翻译而成数据库）、SWISS-PROT数据库、数据库、SPupdate（每周更新的（每周更新的SWISS-PROT数据库）、数据库）、PIR（蛋白质信息资源（蛋白质信息资源 ）和）和GenPeptUpdate

38、(每天更新的每天更新的GenPept)数据库复数据库复合而合而成。因此该数据库是一个较完全的，包含最新信息的成。因此该数据库是一个较完全的，包含最新信息的数据库数据库。u dbEST数据库数据库 由美国国家生物技术信息中心（由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和欧）和欧洲生物信息学研究所（洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑，包括）共同编辑，包括许多生物体的表达序列标签（许多生物体的表达序列标签（EST）肽）肽序列序列标标签签(PST)或部分序列信息或部分序列信息蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法一、蛋白质组表达模式的研究方法n蛋白质组研究中的样品制备

39、蛋白质组研究中的样品制备n蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离n蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组研究中的样品分析鉴定n蛋白质组学研究的生物信息学蛋白质组学研究的生物信息学n定量定量蛋白质组学研究蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法二、蛋白质组功能模式的研究方法n蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质翻译后修饰的研究n蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 概念：概念：把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。 l 低丰度蛋白质检测困难低丰度蛋白质检测困难l 蛋白

40、质表达量差异很小，如在蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确以下时，精确定量成为瓶颈定量成为瓶颈 l 蛋白质表达的瞬时变化蛋白质表达的瞬时变化 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-DE) 荧光差异显示双向电泳（荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE） 结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中，用来检测

41、蛋白质在两种样品中表达表达情况，极情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在。在DIGE技术中，每个蛋白技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。 原理：对于具有原理：对于具有相同离子化能力相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的

42、相对量。 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法一、蛋白质组表达模式的研究方法n蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品制备n蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分离n蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组研究中的样品分析鉴定n蛋白质组学研究的生物信息学蛋白质组学研究的生物信息学n定量蛋白质组学研究定量蛋白质组学研究二、二、蛋白质组功能模式蛋白质组功能模式的研究方法的研究方法n蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质翻译后修饰的研究n蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互

43、协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。构与蛋白质结构功能的关系。 主要研究目标 翻译后修饰翻译后修饰糖基化糖基化乙酰化乙酰化甲基化甲基化羧基化羧基化二硫键二硫键磷酸化磷酸化研究面临的困难：研究面临的困难： 修饰肽的检测的高灵敏度方法修饰肽的检测的高灵敏度方法 蛋白质翻译后修饰的定量分析蛋白质翻译后修饰的定量分析 合适的修饰状态下处理和电离条件合适的修饰状态下处理和电离条件 测定工作量巨大测定工作量巨大 生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同

44、作用（蛋白质复合体、多蛋白质网络）作用（蛋白质复合体、多蛋白质网络）1酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 。典型的真核生物转录因子， 如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。主要特点和优势主要特点和优

45、势1.使蛋白质表现型和基因型相联系使蛋白质表现型和基因型相联系2.筛选筛选cDNA文库文库3.真实反应体内蛋白质真实反应体内蛋白质间相互作用情况间相互作用情况4.不需分离靶蛋白不需分离靶蛋白5.敏感性高敏感性高 缺缺 点点1.假阳性结果假阳性结果 2.假阴性结果假阴性结果 3.限于核内表达的蛋白质的相互作用限于核内表达的蛋白质的相互作用4.不能检测依靠翻译后修饰的相互作用不能检测依靠翻译后修饰的相互作用 靶蛋白制备靶蛋白制备 蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的纯化 蛋白质复合体的质谱鉴定蛋白质复合体的质谱鉴定 基本步骤：基本步骤：包括包括: 基本原理：基本原理：将某种蛋白质以将某种蛋白质以共价键

46、共价键固定在基质（如琼固定在基质（如琼脂糖）上，含相互作用蛋白质的细胞裂解液过柱，先脂糖）上，含相互作用蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶）鉴定靶蛋白的结合蛋白。蛋白的结合蛋白。 得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（bait） 获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质获得足够量、纯度高的与

47、诱饵相互作用的蛋白质 原理：以原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴）纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。定靶蛋白的结合蛋白。 抗抗p53抗体与抗体与HNE1和和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀总蛋白进行免疫共沉淀 SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物 切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/

48、MS）分析，得到相应的肽序列标签）分析，得到相应的肽序列标签 搜索数据库搜索数据库 生理条件下蛋白质之间的相互作用生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 A. 灵敏性不高灵敏性不高 B. 假阳性假阳性C. 受免疫球蛋白的干扰较大受免疫球蛋白的干扰较大 基本原理：基本原理：将高度密集排列的蛋白分将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋品中的靶

49、蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。白进行定性和定量分析。蛋白质组学研究进展蛋白质组学研究进展一、蛋白质组学的产生与发展一、蛋白质组学的产生与发展二、蛋白质组学的相关概念二、蛋白质组学的相关概念三、蛋白质组学研究方法概述三、蛋白质组学研究方法概述四、四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用蛋白质组学在肿瘤研究中的应用（一）（一）研究肿瘤发病机理、寻找用于肿瘤诊断和治疗研究肿瘤发病机理、寻找用于肿瘤诊断和治疗的生物标志物的生物标志物 运用蛋白质组研究技术，通过比较肿瘤组织（细胞）和正常组织（细胞）或肿瘤发展不同阶段组织中，蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异，可以发现与癌变相关的特异性

50、蛋白质，这些肿瘤相关的特异蛋白质不仅可为认识和研究肿瘤发病机理提供线索，而且可作为肿瘤诊断和治疗的生物标志物。如Celis等对膀胱鳞状细胞癌(SCC)和移形细胞癌（TCC）的蛋白质组进行了比较研究，在膀胱癌病人的尿液中找到4种与膀胱癌相关的蛋白质：其中银屑素是SCC的生物标志，可用于SCC的早期诊断、鉴别诊断和病情监控。 。（二）（二）发现肿瘤药物作用的靶点发现肿瘤药物作用的靶点 药物多是通过特异地作用于体内的靶蛋白质而重新调整病人药物多是通过特异地作用于体内的靶蛋白质而重新调整病人的生理功能达到治疗目的。新的药物靶蛋白在药学研究中有重要的生理功能达到治疗目的。新的药物靶蛋白在药学研究中有重要

51、作用。基因组研究提示，作用。基因组研究提示，控制人类疾病的潜在药物靶蛋白控制人类疾病的潜在药物靶蛋白，粗略，粗略估计大约有估计大约有5000-100005000-10000个。然而在过去的个。然而在过去的100100年年发现的药物靶蛋发现的药物靶蛋白只有白只有500-1000500-1000个。因此后基因组时代的一个紧迫任务是发现这个。因此后基因组时代的一个紧迫任务是发现这些药物靶蛋白，为开发治疗人类疾病的新药提供依据。些药物靶蛋白，为开发治疗人类疾病的新药提供依据。 用蛋白质组研究技术，通过比较肿瘤组织（细胞）和正常组用蛋白质组研究技术，通过比较肿瘤组织（细胞）和正常组织（细胞）或肿瘤发展不

52、同阶段组织中，蛋白质在表达数量、表织（细胞）或肿瘤发展不同阶段组织中，蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异，可以发现达水平和修饰状态上的差异，可以发现肿瘤特异性蛋白质肿瘤特异性蛋白质，这些，这些蛋白质不仅可作为蛋白质不仅可作为肿瘤诊断的标志物肿瘤诊断的标志物，而且可作为，而且可作为抗肿瘤药物作抗肿瘤药物作用靶点用靶点，用于，用于治疗肿瘤药物的设计和开发治疗肿瘤药物的设计和开发。 （三）（三）肿瘤药物作用机理研究肿瘤药物作用机理研究 目前，一些抗肿瘤药物在体内的作用机理并不清楚。应用蛋目前，一些抗肿瘤药物在体内的作用机理并不清楚。应用蛋白质组研究技术，分析药物处理过的细胞白质组研究技术，

53、分析药物处理过的细胞/ /组织或体液表达的蛋组织或体液表达的蛋白质组，比较治疗前后的蛋白质组的差异、鉴定其中发现相应变白质组，比较治疗前后的蛋白质组的差异、鉴定其中发现相应变化的蛋白质，可揭示药物的作用机理。化的蛋白质，可揭示药物的作用机理。 如比较抗肝癌化合物如比较抗肝癌化合物OGT 719OGT 719和和5-FU5-FU处理过的肿瘤细胞株的蛋处理过的肿瘤细胞株的蛋白质表达谱，发现二者处理过的细胞蛋白质表达谱发生了类似的白质表达谱，发现二者处理过的细胞蛋白质表达谱发生了类似的变化，这提示变化，这提示OGT 719OGT 719与已知的与已知的5-FU5-FU的作用机制类似，其中核糖的作用机制类似，其中核糖体体RNARNA结合蛋白（嘧啶合成过程中的一种重要蛋白）变化显著，结合蛋白（嘧啶合成过程中的一种重要蛋白）变化显著，可能是二者作用的靶点。可能是二