蛹虫草菌株液体深层发酵研究_虫草素和腺苷及虫草多糖826

1、蛹虫草液体深层发酵研究蛹虫草液体深层发酵研究立富（国际）集团立富（国际）集团福州联富生物科技有限公司福州联富生物科技有限公司蛹虫草深层发酵的蛹虫草深层发酵的研究背景及开发思路研究背景及开发思路立富（国际）集团福州联富生物科技有限公司立富（国际）集团福州联富生物科技有限公司 v 蛹虫草蛹虫草Cordyceps militaris (L.) Link 又名北冬虫夏草、北虫又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草等，属于真菌界草、蛹草等，属于真菌界(Kingdom Fungi)、真菌门、真菌门(Eumycota)、子囊菌亚门子囊菌亚门(Ascomycotina)、子囊菌纲、子囊菌纲(Acsomycetes) 、

2、肉座菌、肉座菌目目(Hypocreales)、麦角菌克、麦角菌克(Clavicipitaceae) 、虫草属、虫草属(Cordyceps),与冬虫夏草属于同属真菌，是虫草属的模式种。与冬虫夏草属于同属真菌，是虫草属的模式种。v 研究表明，蛹虫草含有蛋白质、脂类、糖类、维生素及多种研究表明，蛹虫草含有蛋白质、脂类、糖类、维生素及多种微量元素，微量元素，18种氨基酸齐全，而且含有虫草酸、虫草素、虫草种氨基酸齐全，而且含有虫草酸、虫草素、虫草多糖和超氧化物歧化酶等生物活性物质，并且含量十分丰富。多糖和超氧化物歧化酶等生物活性物质，并且含量十分丰富。蛹虫草简介蛹虫草简介 随着人们对冬虫夏草认识领域的不

3、断扩大，国随着人们对冬虫夏草认识领域的不断扩大，国内外市场对虫草的需求也日趋扩大！天然冬虫夏内外市场对虫草的需求也日趋扩大！天然冬虫夏草其野生资源的稀缺，严重制约了千年国药的生草其野生资源的稀缺，严重制约了千年国药的生物医药保健领域的应用。一种取自天然，又优化物医药保健领域的应用。一种取自天然，又优化于天然的物种正在悄然取代野生冬虫夏草于天然的物种正在悄然取代野生冬虫夏草【蛹虫草蛹虫草】。 【蛹虫草蛹虫草】的化学成分药理、药效与野生冬虫的化学成分药理、药效与野生冬虫夏草极为相似，经中国医学科学院药物研究分析夏草极为相似，经中国医学科学院药物研究分析室、中国科学院沈阳分院理化测试中心等权威部室、

4、中国科学院沈阳分院理化测试中心等权威部门的检测表明，蛹虫草的一些主要营养及药物成门的检测表明，蛹虫草的一些主要营养及药物成份如虫草素、腺苷、虫草多糖、蛋白质等还要高份如虫草素、腺苷、虫草多糖、蛋白质等还要高于冬虫夏草。于冬虫夏草。研究背景研究背景v 蛹虫草在人工条件下培育其子实体蛹虫草在人工条件下培育其子实体, 具有周期长、培养条件复杂具有周期长、培养条件复杂等困难。等困难。v 研究表明研究表明, 蛹虫草的菌丝体和子实体具有基本相同的有效成分蛹虫草的菌丝体和子实体具有基本相同的有效成分, 可可用发酵获得的菌丝体代替子实体生产各种饲用和保键产品。用发酵获得的菌丝体代替子实体生产各种饲用和保键产品

5、。v 通过液体深层发酵培养蛹虫草菌丝体通过液体深层发酵培养蛹虫草菌丝体,可以从发酵液中得到人们可以从发酵液中得到人们需要的物质，而且生长快需要的物质，而且生长快, 生产周期短生产周期短, 获得的虫草菌丝体化学组成获得的虫草菌丝体化学组成与从天然采集的虫草化学组成接近，适合于进行大规模产业化生产与从天然采集的虫草化学组成接近，适合于进行大规模产业化生产,是发展蛹虫草生产的一条崭新的途径是发展蛹虫草生产的一条崭新的途径, 具有很好的开发前景。具有很好的开发前景。研究思路研究思路v 菌株选育：通过分离蛹虫草上的真菌，利用传统的物理菌株选育：通过分离蛹虫草上的真菌，利用传统的物理-化学化学诱变及基因组

6、改组方式选育高产虫草活性物质的菌株。诱变及基因组改组方式选育高产虫草活性物质的菌株。v 培养基及发酵工艺优化：利用单因素和多因素组合优化培养基，培养基及发酵工艺优化：利用单因素和多因素组合优化培养基，经过固相、液体深层双相发酵方式大规模获取富含虫草活性物经过固相、液体深层双相发酵方式大规模获取富含虫草活性物质，特别是虫草素、腺苷及虫草多糖的发酵产物。质，特别是虫草素、腺苷及虫草多糖的发酵产物。v 知识产权与生物安全：具有独立自主知识产权知识产权与生物安全：具有独立自主知识产权,生产所用菌株生产所用菌株是在与多种虫草进行多种生物活性比较试验的基础上择优筛选是在与多种虫草进行多种生物活性比较试验的

7、基础上择优筛选出来安全菌株。出来安全菌株。 高效蛹虫草的工艺流程高效蛹虫草的工艺流程菌株选育及筛选菌株选育及筛选菌菌株株选选育育及及筛筛选选高效蛹虫草菌株的液体深层发酵高效蛹虫草菌株的液体深层发酵v 通过采用化学诱变和物理诱变的方法、筛选出一株高产蛹虫通过采用化学诱变和物理诱变的方法、筛选出一株高产蛹虫草菌株，该菌株的发酵菌丝体在干重、虫草素、腺苷、多糖方草菌株，该菌株的发酵菌丝体在干重、虫草素、腺苷、多糖方面含量都处于较高水平，且遗传稳定，避免了由于片面追求蛹面含量都处于较高水平，且遗传稳定，避免了由于片面追求蛹虫草菌丝体产量而忽略其发酵有效成分的情况。虫草菌丝体产量而忽略其发酵有效成分的情

8、况。v 采用单因素试验方法、采用单因素试验方法、PB试验设计和旋转中心组合、多元线试验设计和旋转中心组合、多元线性回归法、多元二次回归模型等方法对高产蛹虫草菌株液体发性回归法、多元二次回归模型等方法对高产蛹虫草菌株液体发酵培养的培养基、培养条件以及发酵工艺进行了优化，并对高酵培养的培养基、培养条件以及发酵工艺进行了优化，并对高产蛹虫草菌株的发酵工艺进行放大培养。产蛹虫草菌株的发酵工艺进行放大培养。v 利用现代微生物发酵设备，初步实现了利用高产蛹虫草菌株利用现代微生物发酵设备，初步实现了利用高产蛹虫草菌株工业化生产富含蛹虫草活性物质的产品。工业化生产富含蛹虫草活性物质的产品。深层发酵蛹虫草的深层

9、发酵蛹虫草的主要活性成分及其功能主要活性成分及其功能虫草素和腺苷虫草素和腺苷中国药典中国药典v 腺苷和虫草素是蛹虫草中主要有效成分之一，具有广泛的生腺苷和虫草素是蛹虫草中主要有效成分之一，具有广泛的生理活性。理活性。v 腺苷和虫草素可用于提高免疫功能，干扰腺苷和虫草素可用于提高免疫功能，干扰RNA和和DNA的合成，的合成，抑制不正常细胞抑制不正常细胞(如癌细胞如癌细胞)的分裂。临床上可用于治疗癌症、的分裂。临床上可用于治疗癌症、白血病、慢性气管炎、肺心病，降血脂血糖和抗衰老等。白血病、慢性气管炎、肺心病，降血脂血糖和抗衰老等。v 腺苷具有显著的生理活性，腺苷具有显著的生理活性，中国药典中国药典

10、2005年版一部年版一部“冬冬虫夏草虫夏草”项下收载了腺苷的含量测定方法，作为评价冬虫夏草项下收载了腺苷的含量测定方法，作为评价冬虫夏草的质量优劣的标准。其同样也可作为蛹虫草活性产品的质量优的质量优劣的标准。其同样也可作为蛹虫草活性产品的质量优劣的标准劣的标准 。激激活活虫草素及其功能虫草素及其功能v 虫草素虫草素(Cordycepin) 是腺苷的类似物，也是蛹虫草中核是腺苷的类似物，也是蛹虫草中核苷类化合物的主要功能成分，分子式苷类化合物的主要功能成分，分子式: C10H13N5O3，3-脱脱氧腺苷，分子量氧腺苷，分子量 251.24，碱性，针状或片状结晶，熔点，碱性，针状或片状结晶，熔点2

11、30-231，最大吸收波长为，最大吸收波长为259 nm。1951年，德国的年，德国的Cunningham等从蛹虫草的培养滤液中分离发现虫草素。等从蛹虫草的培养滤液中分离发现虫草素。 从结构上看：虫草素分子与腺苷分子的差别主要在于核从结构上看：虫草素分子与腺苷分子的差别主要在于核糖基的其中一个碳的羟基氧去除，在生物体中是通过腺苷糖基的其中一个碳的羟基氧去除，在生物体中是通过腺苷作为直接前体而合成。作为直接前体而合成。虫草素主要作用机制虫草素主要作用机制v 虫草素具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、免疫调节等生物活性，主要作用机制是替虫草素具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、免疫调节等生物活性，主要作用机制是替

12、代腺苷参与了细胞代谢过程，抑制代腺苷参与了细胞代谢过程，抑制mRNA加尾，虫草素加尾，虫草素5三磷酸连至三磷酸连至mRNA的的3端，端，因缺少因缺少3-OH而导致了而导致了mRNA无法延伸，无法延伸， mRNA无法成熟，最终抑制肿瘤细胞或病无法成熟，最终抑制肿瘤细胞或病原细胞的生长。原细胞的生长。RibosomesPABATHFAmRNA*酶酶mRNAmRNA加尾异常，导加尾异常，导致其不稳定及翻译致其不稳定及翻译受阻，无法传代。受阻，无法传代。病毒正常细胞v 虫草素能提高机体单核巨噬细胞的吞噬能力，激活巨噬细胞释放虫草素能提高机体单核巨噬细胞的吞噬能力，激活巨噬细胞释放细胞毒素直接杀伤癌细胞

13、。细胞毒素直接杀伤癌细胞。虫草素主要活性功能虫草素主要活性功能虫草素激活单核巨噬细胞并释放促炎症介质瓦解癌细胞虫草素激活单核巨噬细胞并释放促炎症介质瓦解癌细胞癌细胞癌细胞刺激刺激v Jonnidis等报道了虫草素的抗肿瘤作用与其可以抑制等报道了虫草素的抗肿瘤作用与其可以抑制DNA和和RNA的合成有关，相关研究表明虫草素可以选择性抑制的合成有关，相关研究表明虫草素可以选择性抑制mRNA的合成，从而影响癌细胞蛋白质的合成；的合成，从而影响癌细胞蛋白质的合成；v 虫草素能够有效抑制细胞分裂，促进细胞分化，对淋巴细胞虫草素能够有效抑制细胞分裂，促进细胞分化，对淋巴细胞的转化有明显促进作用，对机体免疫起

14、到调节作用。的转化有明显促进作用，对机体免疫起到调节作用。v 虫草素能增强环磷酰胺的抗癌作用，可以作为临床抗肿瘤药物虫草素能增强环磷酰胺的抗癌作用，可以作为临床抗肿瘤药物的辅助药物的辅助药物: Yoshida等报道了皮下注射虫草素能够明显延长艾氏腹水癌等报道了皮下注射虫草素能够明显延长艾氏腹水癌接种小鼠的存活时间；虫草素还可以导致白血病细胞凋亡和有接种小鼠的存活时间；虫草素还可以导致白血病细胞凋亡和有丝分裂细胞丝分裂细胞S期和期和G2期的延长。期的延长。 Sugar等研究了虫草素对侵入型念珠菌的拮抗作用，证明了等研究了虫草素对侵入型念珠菌的拮抗作用，证明了虫草素有非常强的抗真菌活性。虫草素有非

15、常强的抗真菌活性。虫草素主要活性功能虫草素主要活性功能蛹虫草蛹虫草虫草素虫草素激活免疫系统激活免疫系统诱导癌细胞凋亡诱导癌细胞凋亡与抗癌药协同与抗癌药协同抑制抑制RNARNA形形成及反转成及反转录录促进细胞分化及促进细胞分化及T T淋淋巴细胞转化，增强巴细胞转化，增强吞噬功能吞噬功能协同杀灭协同杀灭虫草素主要活性功能图解虫草素主要活性功能图解虫草素主要活性功能虫草素主要活性功能v 虫草素能刺激糖酵解导致能量合成增加，增强肝脏功能和虫草素能刺激糖酵解导致能量合成增加，增强肝脏功能和肌肉中肌肉中CPKCPK的活性，并能明显增加冠状动脉的血流量，降低的活性，并能明显增加冠状动脉的血流量，降低冠状动脉

16、、脑及外周血管压力；冠状动脉、脑及外周血管压力；v 虫草素能加速肝脏核酸和蛋白质的更新速度，增加脾脏重虫草素能加速肝脏核酸和蛋白质的更新速度，增加脾脏重量，增加心肌营养及降低血清胆固醇和量，增加心肌营养及降低血清胆固醇和脂蛋白的作用。脂蛋白的作用。刺激刺激促进能量代谢促进能量代谢加速血液循环加速血液循环促进物质更新促进物质更新提高机体正常代谢提高机体正常代谢腺苷及其功能腺苷及其功能v 腺苷是由腺嘌呤的腺苷是由腺嘌呤的N-9N-9与与D-D-核糖的核糖的C-1C-1通过通过糖苷键连糖苷键连接而成的化合物，是机体一种重要的中间体，也是合成接而成的化合物，是机体一种重要的中间体，也是合成虫草素的直接

17、前体物。是蛹虫草质量评价指标数据。虫草素的直接前体物。是蛹虫草质量评价指标数据。 腺苷腺苷虫草素虫草素无羟基无羟基腺苷活性功能腺苷活性功能v 腺苷具有改善心脑血液循环、防止心率失常等活性。腺苷具有改善心脑血液循环、防止心率失常等活性。v 腺苷可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量腺苷可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。v 此外，腺苷也是一种抑制性神经传导物，会促进动物体的此外，腺苷也

18、是一种抑制性神经传导物，会促进动物体的睡眠。睡眠。 v 采用踊虫草菌丝进行液体深层发酵，其腺苷的含量均高于采用踊虫草菌丝进行液体深层发酵，其腺苷的含量均高于固体培养的踊虫草子座，这也是液体深层发酵的一大优势。固体培养的踊虫草子座，这也是液体深层发酵的一大优势。虫草多糖及其功能虫草多糖及其功能v 虫草多糖是虫草多糖为高度分枝的杂多糖，主要由虫草多糖是虫草多糖为高度分枝的杂多糖，主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖等单糖组成。为蛹虫草主要甘露糖、半乳糖、葡萄糖等单糖组成。为蛹虫草主要活性成分之一。活性成分之一。v 虫草多糖是虫草中最主要的药理活性成分之一虫草多糖是虫草中最主要的药理活性成分之一, , 通通

19、过深层发酵方法从中获取多糖组份过深层发酵方法从中获取多糖组份, , 改变了以往主要改变了以往主要从资源稀缺的野生子实体中提取有效生物活性物质的从资源稀缺的野生子实体中提取有效生物活性物质的局面局面, , 已成为当前开发人工虫草保健品的重要手段。已成为当前开发人工虫草保健品的重要手段。虫草多糖活性功能虫草多糖活性功能v 虫草多糖对网状内皮系统及巨噬细胞有明显的激活虫草多糖对网状内皮系统及巨噬细胞有明显的激活作用，能促进淋巴细胞转化，是一种非特异性免疫作用，能促进淋巴细胞转化，是一种非特异性免疫增强及调节剂，可激活机体的免疫活性细胞，特别增强及调节剂，可激活机体的免疫活性细胞，特别是淋巴细胞及淋巴

20、因子、单核巨噬细胞系统和是淋巴细胞及淋巴因子、单核巨噬细胞系统和NK细细胞等，从而攻击靶细胞发挥抗肿瘤作用，同时具有胞等，从而攻击靶细胞发挥抗肿瘤作用，同时具有抗衰老、抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂等作用，抗衰老、抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂等作用，能提高免疫力，改善肝功能涎缓衰老等。能提高免疫力，改善肝功能涎缓衰老等。虫草多糖虫草多糖辅助巨噬细胞辅助巨噬细胞肿瘤抗原肿瘤抗原T细胞辅助因子细胞辅助因子激活激活细胞毒细胞毒T T细胞细胞前体前体细胞毒细胞毒T T细胞细胞目标肿瘤细胞目标肿瘤细胞坏死坏死tL-1C3补体补体C3b巨噬细胞巨噬细胞活化的活化的巨噬细胞巨噬细胞过敏毒素过敏毒素C3aT细胞抑制因子细胞抑制因子B cell自然杀伤细胞自然杀伤细胞抗肿瘤抗原抗肿瘤抗原CTLNK cellNK、AFtL-2 MAF虫草多糖的抗肿瘤及免疫激活虫草多糖的抗肿瘤及免疫激活虫草多糖功能总结虫草多糖功能总结(l) 增强免疫系统增强免疫系统(2) 蛹虫草多糖对肝