外源性DNA残留量测定法qPCR法

1、重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法(qPCR法)1原理实时定量PCR (qPCR)扩增分2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的 进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长速度 变慢，反应进入平台期。反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环 数，即6。CT值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度 高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物，产生高过

2、背景的荧光信号，因 此，反应就有一个小或早出现的5 ；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增 循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的C两者之间尖系的 建立是qPCR用于定量的依据。2主要仪器表2仪器信息表名称厂家型号实时定量:PCR仪Bio-RadCFX Co rm ect3主要试剂表3试剂信息表名称厂家残留DNA样品制备试剂盒ABI残留DNA定量检测试剂盒(CHO)ABI1) Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle;2) Bin di ng Solutio n,1 empty bottle;3) Wash Buffer Concentrate

3、, 2 bottles, 26 ml/bottle;4) 日ution Buffer; 1 bottle, 25ml;5) Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml;6) Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube;7) Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml;8) Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml30.5ml;Glycoge n, 2 tubes,5mg/ml,1 .Oml/tube.1) DNA Control J bottle,40 d;2) DN

4、A Dilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml;3) 2 XEn viro nmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube;4) 10 XDNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300 d;5) Negative Con trol, 1 tube51.0mL4溶液配制 4.1蛋白酶K混合液（新配）1 react ion (100 Wsample)10 react ion (100 p/sample)Prote in ase K10p100pProte in ase K Buffer60 p600 p4.2裂

5、解混合液（新配）试齐u体积（P）Glycogen f5mg/ml)180tRNA (10mg/ml)4Lysis Buffer7600合计77844.3 DNA标准品稀释Tube labelDilutio npg/ppg/ reacti onDNA Co ntrol30000300000SD110 p DNA Control+990 pDDB3003000SD250 pSD1+450 pDDB30300SD350 pSD2+450 p DDB330SD450 pSD3+450 p DDB0.33SD550 pSD4+450 p DDB0.030.3SD650 pSD5+450 p DDB0.0

6、030.03NTCDDB00注：DNA标准品溶液4c放置保存1天2 0c放置保存1周。5测定方法 5 1样品处理51.1除蛋白1 ）在2ml离心管中加入100 pl样品;2)3)每100p的样品中加入70P的蛋白酶K混合液，混合均匀，56c水浴30min ；每100 p的样品中加入360 p的裂解液,室温裂解2小时以上。5.1.2 DNA的纯化1）磁珠使用前于37匚温浴10min,高速涡旋，彻底悬浮磁珠；2 ）每100 p的样品加入30 p的磁珠悬浮液；3）每100 p的样品加入300 p的Binding Solution、涡旋混合5min ；4） 12000r/min离心30sec将离心管放

7、置于磁力架上，静置5min直至溶液 清 澈，弃上清；5）从磁力架上取下离心管，力口入300 p的Wash Buffer,涡旋混合5 sec；6） 12000r/min离心30sec,将离心管放置于磁力架上，静置2min,弃上清；7）重复步骤6） 1次，打开离心管的盖子，室温下风干；力口入 50 P 的日ution Buffer,高速涡旋10$66 70（：处理1001伯,在温浴 过 程中，涡旋2s3次;9) 12000i7min离心30sec,将离心管放置于磁力架上，静置2min,将含有 洗脱DNA的液体转移到新的1 -5ml的离心管中，用于进行qPCR反应。5.2 PCR反应体系1）标准品、

8、NTC和样品均做2个复孔;2）反应母液用量按表4进行计算：表4PCR反应体系Kit Reage ntsVolume for 1 30- d reaction(d)Volume for 36 30- d react ion9)Negative Con trol27210 XDNA Resl-Time PCR Assay Mix31082 Environmental Master Mix15540DNA template10N/A合计307205.3 PCR仪运行程序设置5.3.1 PCR反应体系1 ）标准品、NTC和样品均做2个复孔;2 ）反应母液用量按表5进行计算：表5PCR反应体系Kit R

9、eage ntsVolume for 1 30- d react ion(d)Volume for 36 30 d reactionNegative Con trol27210 >DNA Resl-Time PCR Assay Mix31082 Environmental Master Mix15540DNA template10N/A合计30720荧光基团选择FAM ；1)2)5.2.2 PCR仪运行程序设置96孔反应模块设置见下表，样品根据实际数量依次设置:123456789101112ASD1SD1样品1样品1BSD2SD2样品2样品2CSD3SD3样品3样品3DSD4SD4ESD5SD5FSD6SD6GNTCNTCH3） PCR反应条件设置步骤温度时间(min:sec)195 C10:00295 C0:10360 C0:304GOTO 2,39 循环4）运行上述设置的程序6接受标准1）标准曲线：