选修一2-2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》课件(陈)

1、1.1.尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2 重要的农业氮肥。重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为只能被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸收利用才能被植物吸收利用 2.CO(NH 2.CO(NH2 2) )2 2 + H + H2 2O COO CO2 2 +2NH+2NH3 3细菌脲酶细菌脲酶一、课题背景一、课题背景二、研究思路二、研究思路 （一）筛选菌株（一）筛选菌株 1.提出的问题提出的问题 如何寻找如何寻找耐高温耐高温的酶？的酶？ 2.解决问题的思路解决问题的思路 寻找寻找耐高温耐高温环境；环境； 3.原理原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，高温淘汰其他菌，选出耐

2、高温细菌， 耐高温菌种提取耐高温酶。耐高温菌种提取耐高温酶。（一）筛选菌株（一）筛选菌株KHKH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 琼脂琼脂 15.0g15.0g 将上述物质溶解后，将上述物质溶解后，用 蒸 馏 水 定 容 到用 蒸 馏 水 定 容 到1000mL1000mL。 1.该培养基的配方中，该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？氮源的分别是什么物质？ 2

3、.此配方能否筛选出产此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？生脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮细菌能利用尿素作为氮源而生存。源而生存。4.允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻抑制或阻止其他种类止其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养选择培养基基尿素尿素尿素尿素以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培

4、养基类型培养基类型是否是否接种接种 目的目的 结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是二、研究思路二、研究思路 （一）筛选菌株（一）筛选菌株1 1、选择培养基：、选择培养基： 允许允许特定种类的微生物生长，同时特定种类的微生物生长，同时抑制抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。或阻止其他种类微生物生长的培养基。2 2、菌株：、菌株： 纯且活状态所保存的菌种 。（二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目： 1 1、活体计数法（、活体计数法（稀释涂布平板稀释涂布平板） （1 1）操作方法：）操作方法： 稀释涂布平板稀释涂布平板统计菌落数统计菌落数 （2 2）原理：）原理：

5、1 1个菌落个菌落11个活菌个活菌 （3 3）统计原则）统计原则 选选 3030 300300 个菌落的平板统计个菌落的平板统计 每个稀释度取每个稀释度取3 3个平板取个平板取其其平均平均值值为什么？ 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂

6、布了A A、B B、C C三个平板，三个平板，统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三，该同学以这三个平板上菌落数的平均值个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值在设计实验时，一定在设计实验时，一定要涂布至少要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力个平板

7、，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性与准确性。在分析实验结果时，。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验重新实验。（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目 1 1、活菌计数法、活菌计数法 （4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目际数目低低，因此统计结果一般用菌落数表示。，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数= =（C/V)C/V)* * M M C: C:某一稀释度下平板上生长的平

8、均菌落数；某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V: V:所用稀释液的体积；所用稀释液的体积； M:M:稀释倍数。稀释倍数。为什么？计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数 =（CV）M某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B如何对细菌进行计数？ 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为过程中，从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，的培养基中，A A、B B两同学分别

9、得到以下两种统计结果。两同学分别得到以下两种统计结果。 1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。 2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。 B B认为认为A A的培养基被杂菌污染了，或培养基的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。素的细菌也能在该培养基中生长。A A确认自己确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助请你帮助A A同学改进实验，提供具有说明同学改进实验，提供具有说明了的证据。了的证据。

10、设置对照设置对照同等条件下，培养空白培养基同等条件下，培养空白培养基（三）设置对照 1、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 2. 2.对照实验对照实验-指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。（三）设置对照（三）设置对照改进措施：改进措施：判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落

11、数目。观察菌落数目。四、实验过程四、实验过程 （一）土壤取样（一）土壤取样 1 1、天然培养基和合成培养基：、天然培养基和合成培养基： 2 2、土壤取样：、土壤取样： （1 1）取样的）取样的位置位置： 土壤，天然培养基土壤，天然培养基，含有大量的微生物，含有大量的微生物，其中其中7070 9090是细菌。在富含有机质的土壤是细菌。在富含有机质的土壤层的层的3 3 8c8cm m处中分布着绝大多数的细菌。处中分布着绝大多数的细菌。 （2 2）取样要求：铲去表层土。）取样要求：铲去表层土。注意注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要在使用前都要灭菌灭菌

12、。 菌落计数菌落计数配制土壤配制土壤溶液溶液系列稀释系列稀释涂布平板涂布平板与培养与培养(1)作样品系列稀释液作样品系列稀释液 (2)用适当的稀释液涂布平板用适当的稀释液涂布平板（二）样品稀释 1.稀释度（1）测细菌细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌真菌数：一般用102、103、104稀释液原则原则：确保平板上的菌落数在30 300之间。（ 实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。问题：（问题：（2424页）页）为什么为什

13、么分离不同的微生物要采用分离不同的微生物要采用不同的稀释度不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？相同吗？（三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2、培养：细菌：30 37，1 2d; 放线菌:25 28, 5 7d; 霉菌: 25 28, 3 4d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象 （四）鉴定：筛选后必鉴定（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物鉴别培养基：不影响微生物的生存。的生存。酚红培养基酚红培养

14、基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分原理：脲酶催化尿素分解成氨解成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性 在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。特征。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、形态、大小、边缘、突起、颜色、质地质地等等，都是区分细菌的重要手段。等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。 1 1、取土用的小