化妆品中荧光增白剂367和荧光增白剂393的测定液相色谱-串联质谱法-编制说明

1、国家标准化妆品中荧光增白剂 367和荧光增白剂 393的测定 液相色谱串联质谱法征求意见稿编制说明一、工作简况1、任务来源本标准根据国家标准化管理委员会 国家标准委关于下达 2016年第一批国家标准制修订计划的通知（国标委综合 2016 39 号）立项，项目编号为20160676-T-607。主要起草单位：上海市日用化学工业研究所（国家香料香精化妆品质量监督检验中心） 、苏州质量科学检测研究院、 广州质量监督检测研究院等。计划应完成时间 2019年。2、主要工作过程起草阶段：a) 2017年 1 月-2017 年 12 月，成立标准制定工作组。 根据国标委综合 201639 号下达的国家标准制

2、修订计划任务的通知， 承担单位组成标准编制工作小组，查询、收集和认真研究国内外标准及相关资料， 并结合实验室的条件、 化妆品基质特性和方法技术特点，初步设计实验方案。b) 2018 年 1 月-2019 年 04 月，实验研究工作。根据实验方案，优化确定色谱分离条件和仪器检测条件， 优化确定水剂类、 乳液类、非蜡基膏霜类和面膜化妆品产品的提取、净化条件，考察方法的灵敏度、准确性、线性范围和适用性，并组织单位进行方法验证；编写标准征求意见稿和编制说明。3、主要参加单位和工作组成员等本标准由上海市日用化学工业研究所 （国家香料香精化妆品质量监督检验中心）、苏州质量科学检测研究院、广州质量监督检测研

3、究院等负责联合起草。本标准主要起草人： ×××。二、标准编制原则和主要内容1、标准编制原则本标准遵循 GB/T 1.1-2000标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则和 GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法的编写1规则，并参考了国家食品药品监督管理总局发布的化妆品中禁用物质和限用物质检测方法验证技术规范。2、标准研制背景化妆品作为人们日常生活的必需品，一直受到全世界人民的关注。 特别是随着人们生活水平的提高以及消费能力的增强，越来越多的人群开始注重自身妆容，这就对化妆品的质量及功效有了更高的要求。为了使消费者在使用

4、化妆品后能够改善肤色，使皮肤更加白嫩， 生产商会向化妆品中添加某些准用着色剂，如二氧化钛、 氧化锌等。 为了追求更好的美白效果及美白速度， 一些不法厂商会在其产品中违禁添加一些违禁化合物，如汞、荧光增白剂等。使用添加了这些违禁化合物的化妆品产品， 消费者最初会觉得效果很好，但长期使用会造成皮肤损伤，甚至有可能导致全身性损害。 化妆品安全技术规范（ 2015 版）未将荧光增白剂列入准用着色剂名单中。迄今为止，关于化妆品中的荧光增白剂的检测仍未有相关配套检验方法。近年来，我国媒体有关于“化妆品中存在荧光增白剂”的报道，主要集中在面膜产品，其检测方法为采用紫外灯对面膜样品进行照射， 样品有荧光时，

5、即报道称面膜产品中含有荧光增白剂。 面膜产品基质复杂， 无纺布和精华液原料中都可能含有荧光物质， 在紫外光下发出荧光， 因此，仅用紫外灯照射来判定化妆品中是否含有荧光增白剂是不可靠的，也是对化妆品行业声誉的一种伤害。因此，无论是监测化妆品中违法使用非准用物质，保障化妆品质量安全， 还是维护化妆品行业声誉的健康发展，建立准确可靠的化妆品中荧光增白剂的检测方法都是十分必要的。本标准选取了荧光增白剂367 和荧光增白剂 393 为研究对象，拟通过对检测方法的优化探索，采用液相色谱-串联质谱技术，建立化妆品中荧光增白剂367和荧光增白剂 393 的液相色谱 -串联质谱测定方法标准，不仅为主管部门加强对

6、化妆品的监管提供必要的技术支持，还可以为其他荧光增白剂检测提供参考。化妆品基质种类较多， 基质成分和特性相差较大， 如膏霜、乳液类化妆品基体含有较多的酯类、 醇类物质、色素和防腐剂等复杂成分， 这些物质的存在极易干扰目标化合物的检测， 因此，高效提取和良好色谱分离是本方法的难点和关键点。本标准通过优化提取溶剂、梯度洗脱程序、色谱柱等关键因素，采用高效液相色谱串联质谱仪建立了化妆品中荧光增白剂367 和荧光增白剂393 的检测方2法。3、解决的主要问题本研究通过优化目标化合物的液相色谱和三重四级杆质谱检测参数， 以及对不同类型样品的前处理方法进行摸索， 最终建立了一套标准性的检测方法， 解决的主

7、要问题包括：（ 1）确立了高效液相色谱 -三重四极杆质谱联用仪的检测参数，包括色谱柱、洗脱程序、流动相、质谱参数的选择；（ 2）确定了前处理方法，包括提取溶剂、提取方式的选择；（ 3）完成了方法学的考察， 包括线性范围、方法检出限和定量限、 基质效应、回收率和精密度、方法稳定性等；（ 4）完成了方法的适用性试验，对市售水剂类、非蜡基膏霜类、乳液类化妆品以及面膜样品进行了检测。4、修订标准时应列出与原标准的主要差异和水平对比该标准属首次起草，无与原标准的主要差异和水平对比。5、标准的技术路线和确定依据5.1 主要技术路线主要技术路线图见图1。图 1 主要技术路线图5.2 标准物质信息荧光增白剂

8、367 和荧光增白剂 393 标准物质信息和结构式见表1。3表 1 荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 的化合物信息和结构式序号中文名称英文名称CAS 号分子式相对分化学结构式子质量1荧光增白Fluoresent5089-22-5C24H14N2O2362.38剂 367Brightener 3672荧光增白Fluoresent1533-45-5C28H18N2O2414.45剂 393Brightener 3935.3 仪器参数的选择与优化质谱参数的选择本项目中的荧光增白剂367 和荧光增白剂 393 均属于苯并噁唑型化合物， 噁唑环上的氮原子在酸性条件下容易加氢， 形成 M+H +分

9、子离子峰， 更适合在 ESI 正模式下检测。实验中使用 AB Qtrap 5500 三重四极杆质谱，在 ESI 电离源正离子模式下优化了 MS/MS 采集参数。优化所用的单标标准溶液浓度为 1.0 mg/L，通过采集得到了各化合物的特征碎片离子， 并对质谱参数进行了优化， 质谱参考工作如下：a) 离子源：电喷雾离子源（ ESI）；b) 扫描方式：正离子扫描；c) 喷雾电压： 5500 V；d) 离子源温度： 400；e) 雾化气压力： 0.276 MPa；f) 辅助气压力： 0.414 MPa；g) 气帘气压力： 0.276 MPa；h) 检测方式：多反应监测（ MRM ）；i) 母离子、子离

10、子、去簇电压、碰撞室出口电压（ V ）及碰撞电压见表 2。表 2 荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 标准物质的质谱参数化合物母离子子离子去簇电压碰撞室出口碰撞电压/ （ m/z）/（ m/z）/V电压 /V/V荧光增白剂 367363.1270.1 a，244.113015.055.0，60.0荧光增白剂 393415.3321.1a， 207.212015.055.0，55.0a 定量离子色谱柱的选择鉴于 C18色谱柱通用性好，价格相对较低，用户容易获得。实验首先使用超4高效常规 C18色谱柱（ ACQUITY UPLC BEH C 18，1.7 m，50 mm×2.1 m

11、m）对荧光增白剂 367和荧光增白剂 393的分离情况进行考察。 结果发现该色谱柱对两种化合物均有保留， 调节不同流动相种类和比例，可使化合物峰形尖锐对称， 达到最优化效果。使用其他品牌的超高效C18色谱柱（如安捷伦ZORBAXEclipse PlusRRHD C 18、Thermal Hypersil GOLD C 18等），同样能达到分离要求。流动相的选择流动相是影响分离效果的一个重要因素。在实验中，流动相的选择和优化是确定色谱分析的主要工作。所选用的流动相应具有以下特点：1）纯度高、化学稳定性好，不与固定相和样品组分发生化学反应；2）粘度要小，防止柱压过高；3）对待测样品具有合适的极性和

12、选择性。本标准涉及的荧光增白剂367 和荧光增白剂 393 为苯并噁唑结构的分子， 分子极性相对偏小，分子中无活泼性基团，不易受流动相pH 值影响；由于其在常规 C18 色谱柱上有很好的保留， 实验首先比较了反相高效液相色谱中经常使用的流动相体系（乙腈 /水、甲醇 /水体系）的分离效果。结果表明，两种流动相均能实现两种化合物的洗脱，但化合物峰形均较宽，半峰宽达0.2 min ；为了优化化合物峰形，采取了增加流动相中有机相比例（从 90%增加至 95%）以及使用 5 mmol/L 乙酸铵溶液作为水相进行洗脱两种措施，最终达到了良好的分离效果，半峰宽约 0.1 min，响应值也在可接受范围内。鉴于

13、前处理过程中使用乙腈提取，且乙腈 /乙酸铵体系的粘度较甲醇 /乙酸铵低，色谱柱压力相对小，实验最终选择乙腈和 5 mmol/L 乙酸铵体系作为流动相。综上，最终确定的高效液相色谱参数如下， 在优化的仪器条件下， 荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 的提取离子色谱图如图 2 所示。a) 色谱柱： C18 柱， 1.7 m，50 mm × 2.1 mm（内径）；b) 流动相：乙腈和5 mmol/L 乙酸铵溶液，梯度洗脱条件见表3；c) 流速： 0.3 mL/min ；d) 柱温： 30 ；e) 进样量： 5 L。5表 3高效液相色谱梯度洗脱程序时间 /min乙腈 /%5 mmol

14、/L 乙酸铵溶液 /%0.050501.050503.59556.09556.150508.05050图 2荧光增白剂367 和荧光增白剂393 的液相色谱串联质谱多反应监测色谱图5.4 前处理条件的选择与优化萃取溶剂的选择本标准涉及的荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 为苯并噁唑结构的分子， 且含有多个苯环，化合物在三氯甲烷、乙腈、甲醇、正己烷等有机溶剂中均有一定溶解度，不溶于水，因此目标物检测过程中需使用有机溶剂进行提取。此外，诸如膏霜类等化妆品中含有大量脂溶性物质， 此类物质会干扰目标化合物的质谱响应，一般净化后再使用质谱检测。由于三氯甲烷、二氯甲烷此类溶剂毒性较大，且提取后不能直

15、接进液相色谱进行分析， 需要进行溶剂置换， 会造成大量有毒溶剂排放及浪费， 因此实验中未考虑使用三氯甲烷、 二氯甲烷等溶剂提取。 实验直接设计了乙腈或甲醇进行样品提取，正己烷溶液进行液 -液萃取除脂净化的前处理手段，并利用阴性水剂、 非蜡基膏霜、乳液和面膜样品加标 （加标量 2.0 mg/kg）6来考察了此前处理手段的提取回收率。结果见图 3，此前处理步骤的提取回收率很低，均在 40%以下，推测是正己烷溶液除脂净化过程中，萃取了部分目标物；为了验证此推测，实验将样品的乙腈或甲醇提取液稀释后直接检测，结果发现，回收率在 85.0 115%之间（基质标准曲线校正结果），完全满足提取实验要求。由于直

16、接提取液经基质标准曲线校正后完全满足了实验要求， 为了节约检测成本和与流动相条件一致， 实验最终选取乙腈直接提取， 提取液稀释、 过滤后直接进行测试的前处理方法，而没有将提取液进一步使用固相萃取柱净化。图 3 不同前处理方式下，各加标样品的回收率（提取液为乙腈提取液）提取条件的选择比较了振荡提取和超声提取两种提取方法，结果表明，超声提取操作简便，提取效率较高。实验比较了超声时间为5、10、15、20、30 min 时的提取率。结果表明，超声时间对测定结果影响不大。由于不同品牌样品的致密性、黏度等不同， 为避免由于超声时间过短而导致回收偏低，超声时间选择5 30 min 的中间点 15 min。

17、最终确定的样品前处理条件称取 0.5 g（精确至0.00 1 g）试样，置于 25 mL 具塞比色管中，加入8 mL7乙腈，涡旋混匀，超声提取 15 min，冷却至室温，用乙腈定容至刻度，取 1.5 mL 至离心管中， 1 0000 r/min 离心 3 min，取 1.0 mL 上清液，用乙腈稀释至 10 mL，稀释液经滤膜过滤后供高效液相色谱 -三重四级杆质谱联用仪测定。三、主要试验（或验证）情况分析1、试验分析1.1 线性关系、检出限和定量限配制荧光增白剂367 和荧光增白剂393 的混合标准工作溶液，浓度分别为1.00g/L 、2.00g/L 、5.00g/L、10.0g/L 、 20

18、.0g/L 和 50.0g/L ，按优化的仪器条件进行检测， 以各化合物定量离子对色谱峰面积为纵坐标， 标准溶液质量浓度为横坐标，进行线性回归，制得标准工作曲线（y 为峰面积，x 为浓度，g/L）；采用阴性样品进行添加回收试验， 定量添加混合标准工作溶液， 按照试样前处理方法和仪器条件进行测定， 以信噪比 S/N = 3 确定方法检出限，以信噪比 S/N = 10 确定方法定量限，结果见表 4。荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 在 1.00 50.0 g/L 范围内线性关系良好， 线性相关系数均大于 0.998，其方法检出限均为 0.100 mg/kg，定量限均为 0.300 mg/k

19、g；可满足化妆品中荧光增白剂 367 和荧光增白剂393 的定量分析。表 4 荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 的线性方程、 相关系数、 仪器检出限和定量限、化合物荧光增白剂 367 荧光增白剂 393方法检出限和定量限线性方程相关系数方法检出限方法定量限(mg/kg)(mg/kg)y = 187370 x -316910.99890.1000.300y =119858x -949530.99810.1000.3001.2 基质效应基质效应是指由于样品的差异， 样品中的干扰物质能够抑制或增强分析物在质谱的响应。基质效应可以用基质标准曲线与纯溶剂标准曲线的斜率的比值进行评估。基质标准曲线

20、可以通过阴性样品提取液作为溶剂来配置。 本实验中，荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 在不同基质中的标准曲线图见图 4（为了图清晰效果，低浓度仅选择了一个浓度点进行绘制标准曲线）。从图中可以看出，爽肤水样品的标准曲线斜率较溶剂标准曲线略有下降， 柔肤乳样品基质标准曲线斜率下8降较大，约下降 40-50%，粉底样品斜率增加，约增加 30-40%；表明荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 的质谱信号被水剂样品中的干扰物抑制不大， 在柔肤乳样品中抑制较明显， 在粉底样品中存在了基质增强的现象。 考虑到化妆品的基质的复杂性和确保试验结果准确，方法统一使用基质标准曲线进行外标法定量。(a)图

21、4 不同基质样品中，荧光增白剂367（ a）和荧光增白剂393（ b）的标准曲线1.3 回收率与精密度9选取水剂、非蜡基膏霜类、 乳液类阴性化妆品和面膜样品分别进行3 个水平的加标回收实验并计算平均回收率，添加浓度为0.300、0.600 和 3.00 mg/kg，每个添加浓度按照确定的分析方法做6 次平行测定，测得平均回收率和相对标准偏差（ RSD）见表 5。可见，在添加浓度范围内，化妆品中荧光增白剂367 和荧光增白剂 393 的平均回收率在84.7% 112.0%之间，相对标准偏差（ RSD，n = 6）在 3.6% 11.7%之间，方法具有良好的回收率和精密度。表 5回收率和精密度（

22、n = 6）测定结果基质目标物平均回收率 (%)精密度 (%)润肤乳荧光增白剂 36793.8， 92.6，94.110.9，7.6，5.3荧光增白剂 39388.4， 91.8，97.18.9， 5.5，4.7粉底荧光增白剂 367112.0，97.3， 102.610.9，7.1，5.1荧光增白剂 393108.0，90.2，93.211.7， 9.7， 8.7柔肤水荧光增白剂 367101.4，96.9，95.37.3， 5.8，4.1荧光增白剂 39395.7， 97.2，97.68.1， 7.2，3.6面膜荧光增白剂 36784.7， 88.9，95.710.2，8.9，5.4荧光增

23、白剂 39393.2， 90.8，98.69.7， 8.5，6.71.4 方法稳定性日内稳定性选取阴性水剂、粉底和面膜样品分别进行加标回收实验，加标水平为0.600mg/kg，在正常实验条件放置24 h，选取放置 6 个不同时间段分别进行测定，按照确定的分析方法做2 次平行实验，计算回收率的平均值和相对标准偏差（ RSD），以此来衡量方法日内稳定性， 结果见表 6。由表 6 可知，在 24 h 之内，不同基质之间，荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 的相对标准偏差在 4.9% 8.2%之间，日内稳定性良好。表 6日内稳定性试验结果基平均回收率(%) （ n=2 ）平均值RSD目标物质放置

24、放置放置放置放置放置(%)(%)0 h2 h4 h8 h12 h24 h柔荧光增白剂 367102.7101.3100.095.393.089.797.05.3肤荧光增白剂 39396.493.2105.2103.9100.295.399.04.9水粉荧光增白剂 367106.0100.190.288.7101.687.295.68.210基平均回收率(%) （ n=2 ）平均值RSD目标物质放置放置放置放置放置放置(%)(%)0 h2 h4 h8 h12 h24 h底荧光增白剂 393108.3104.1102.986.9103.594.5100.07.9面荧光增白剂 36796.390.3

25、101.786.2104.395.895.87.1膜荧光增白剂 39398.486.498.687.8101.799.795.46.9日间稳定性选取阴性水剂、粉底和面膜样品进行部分水平的加标回收实验，在正常实验条件放置3 天，每天分别进行测定，按照确定的分析方法做2 次平行实验，计算回收率的平均值和极差，以此衡量方法的日间稳定性，结果见表7。由表 7 可知，在 3 天之内，不同基质之间， 荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393 的极差在 6.6 14.0 %之间，极差不超过平均值的 15%，日间稳定性良好。表 7日间稳定性试验结果基质柔肤水粉底面膜平均回收率(%) （ n=2）目标物平均值极

26、差放置 0(%)(%)放置 1天放置 2天放置 3天天荧光增白剂 36794.793.297.8102.697.19.7荧光增白剂 393102.298.796.7103.3100.26.6荧光增白剂 367106.092.3101.093.298.114.0荧光增白剂 393107.995.498.7109.5102.913.7荧光增白剂 36792.6104.8103.198.499.712.2荧光增白剂 39395.2106.7102.292.999.313.91.4 样品实测情况随机抽取市售的水剂类、乳液类、非蜡基膏霜类、面膜等化妆品各10 份，样品大部分为宣称具有美白功能的化妆品，

27、应用本项目建立的方法进行检测， 以基质标准曲线外标法计算含量， 所有样品均未发现标准中涉及的荧光增白剂 367 和荧光增白剂 393。2、验证分析深圳市计量质量检测研究院、 河北省食品检验研究院、 南京市产品质量监督11检验院、广东产品质量监督检验研究院、国家化妆品质量监督检验中心（广东）共 5 个实验室对本标准方法进行样品测定验证试验和回收率验证试样，验证结果见表 8。可见，在添加浓度范围内，不同验证单位测得荧光增白剂367 和荧光增白剂 393 的平均回收率在92.1% 111.1%之间，实验室间的精密度为1.3% 6.2%，阳性样品的检测结果无明显差异，表明方法具有良好的回收率和精密度。

28、化妆品基目标物质荧光增白剂 367润肤乳荧光增白剂 393荧光增白剂 367爽肤水荧光增白剂 393荧光增白剂 367粉底荧光增白剂 393荧光增白剂 367面膜荧光增白剂 393表 8验证试验结果添加值回收率 (%)平均回收率RSD(mg/kg)单位 1单位 2单位 3单位 4单位 5（ % ）(%)0.30090.095.788.297.395.293.34.20.60099.592.998.989.588.994.05.43.0095.398.190.795.388.993.74.00.30096.494.190.088.899.493.74.70.60093.592.291.394.692.992.91.33.0097.691.099.393.197.495.73.60.30099.394.693.494.5100.396.43.30.60095.994.296.593.597.295.51.63.0097.999.593.093.893.09