蛋白提取及WB步骤

1、Western blot 实验1) 蛋白裂解液的配制：Urea (7 M) 4.2 g, Thiourea (2 M) 1.52 g, CHAPS (4% W/V) 0.4 g, DTT (1% W/V) 0.1 g, ddH2O加至10 ml, 1 ml/管分装-20C保存备用；1 ml分装的 裂解液中用前加入 Cocktail( 1% V/V) 10 pl，混匀后于冰上放置备用。我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒2) 蛋白样品制备(1) 取组织，称重，按照 W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；(2) 用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。(3) 4 °C,冰上放置30mi

2、n,每10 min振荡一次；(4) 4 C, 12000 g离心30 min,吸上清，分装置于-70 C待用。3) 蛋白浓度测定(Bradford法)试剂配制：考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g, 95%乙醇25 ml ,出卩。4 50 ml, ddH2O加至500 ml,过滤后储存于4 C。牛血清白蛋白(BSA): 1 mg/ml步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值(波长595 nm),将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。取待测标本，正确设置 reference,取适量标本，进行浓度测疋。管号BS

3、A (1 mg/ml)0.9% NaCl/0.1 M PBS考染液00200 p1 ml15195 p1 ml210190 p1 ml315185 p1 ml420180 p1 ml525175 p1 ml我们用的是国产碧云天的BCAS白浓度测定试剂盒。4) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(1) 凝胶制备：30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g,甲叉双丙烯酰胺0.8 g,ddH2O加至100 ml, 置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 ym微孔滤膜过滤后4 C保存 于棕色瓶中备用。1.5M Tris (pH8.8)： Tris 18.17 g, HCI 调至 pH8.8,

4、ddHzO 至 100 ml;经验配制：配制1.5 M Tris ( pH8.8)500 ml时直接加入10 M HCI (即HCI 原液)15 ml，不用再调pH。0.5M Tris( pH6.8)： Tris 6.057 g, ddH2O 加至 100 ml，HCI 调至 pH 6.8。10%SDS: SDS 1 g, ddHzO 加至 10 ml。10%过硫酸铵：过硫酸铵 0.1 g，ddH2O加至1 ml。电泳缓冲液：Tris 3.02 g,甘氨酸 14.4 g, SDS 1 g, ddHzO 加至 1000 ml。转膜缓冲液：Tris (15.6 mM)1.93 g,甘氨酸(120

5、mM)9 g, ddH2O 至 1000 ml 。凝胶制备:成分12%分离胶(5 ml)5%浓缩胶(4 ml)30.8%丙烯酰胺2.0 ml0.67 ml1.5M Tris (pH8.8)1.3 ml-0.5M Tris (pH6.8)-0.5 ml10%过硫酸铵0.05 ml0.04 ml10%SDS0.05 ml0.04 mlTEMED0.002 ml0.004 mlH2O1.6 ml2.7 ml步骤：将电泳槽装置安装好，根据需要量配置分离胶，灌注，用饱和正丁醇 封液面，室温30 min60 min待胶凝固后，去除正丁醇，配制浓缩胶，灌注，将 加样梳放入，室温30 min60 min待胶凝

6、固后即可上样电泳；(2) 上样：将蛋白质标本中加入 2XLoading Buffer 0.2% (g/v) bromophenol blue, 4% (g/v) SDS, 20% glycerol, 200 mM 2-mercaptoethanol ( DTT) , 100 mM Tris (pH 6.8),煮沸 5 min10 min , 12000 rpm离心后加样；(3) 电泳：浓缩胶10 mA恒流电泳至交界处，分离胶20 mA恒流电泳至溴 酚蓝到达凝胶下缘，可根据蛋白分子量的大小确定电泳的位置；我们是bioworld的机子，一般可以电泳用恒压 80V跑到底。5) Western blo

7、t分析(1) 半干转膜仪转膜(具体和实验室机子有关)：剪与凝胶大小一致的PVDF 膜一张(膜用之前的处理：甲醇浸泡 min,ddH20浸泡5min，然后和滤纸一起泡 到转缓里)，滤纸12张，浸泡于转膜缓冲液中至少20 min,先将滤纸逐层置于转 膜仪上，用下胶尺逐层赶尽气泡，加上 PVDF膜，赶尽膜与滤纸间的气泡，将聚 丙烯酰胺凝胶放在PVDF膜上，赶尽凝胶与尼膜之间的气泡，逐层加上滤纸，要 尽量排放整齐；按照0.8 mA/cm21 mA/cm2的功率恒流转膜2 h2.5 h。注意正负 极。我们一般用的是250ma转两个小时。(2) 将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBS中封闭2 h;(3) 加入5%脱脂奶粉