HXY基因工程概述

1、1会计学HXY基因工程概述基因工程概述第一章 基因工程概述第二章 基因工程的载体和工具酶第三章 基因的常规技术第四章 基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达第五章 转基因植物第六章 转基因动物第七章 基因治疗（选讲、自修）第八章 蛋白质工程（选讲、自修）平时成绩30%闭卷考试 70%名词解释出勤课堂课堂表现小综述填空题 选择题 100%判断题 问答题 生物技术通报生物技术通报 中国生物工程杂志中国生物工程杂志 农业生物技术学报农业生物技术学报 生物工程学报生物工程学报 生物技术生物技术 遗传遗传 Molecular genetics and genomics Animal biotechnology

2、 Nature genetics Plant cell Science Nature小综述推荐内容和写作要求1. 每人从中任意选择一个大题目（也可以自每人从中任意选择一个大题目（也可以自己另选一个题目），或在大题目下自己立一己另选一个题目），或在大题目下自己立一个分题目，但不能与其他人重复。个分题目，但不能与其他人重复。2. 每个题目都要写出原理、产生、发展历每个题目都要写出原理、产生、发展历史、现状、发展趋势、理论或实践意义。史、现状、发展趋势、理论或实践意义。3. A4纸打印。纸打印。1. 单色和多色荧光原位杂交（单色和多色荧光原位杂交（FISH）2. RNA干扰（干扰（RNAi）及其应用

3、）及其应用 3. 生物芯片（生物芯片（chip）4. 基因扩增（基因扩增（PCR）5. 基因库（基因库（gene bank）及序列的查询和分析）及序列的查询和分析6. DNA测序测序7. 酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（ELISA）8. 遗传病的基因治疗遗传病的基因治疗 9. 噬菌体展示噬菌体展示 （phage display） 10. 酵母双杂交及其衍生系统酵母双杂交及其衍生系统 11. 基因疫苗基因疫苗 12. 基因打靶基因打靶 （gene targeting)13. 随机多肽文库（随机多肽文库（RPLs） 14. 转基因植物转基因植物 14. 转基因植物转基因植物 15. 转基因动物

4、转基因动物 16. 定点突变定点突变 17. 细菌表面呈现（细菌表面呈现（Bacterial surface display） 18. 动物克隆动物克隆 19. 胚胎干细胞（胚胎干细胞（ESC） 21. 内含肽（内含肽（intein）及其应用）及其应用 20. 差异显示差异显示 22. 限制性内切梅限制性内切梅 23. 基因工程载体基因工程载体 24. 生物软件及其使用生物软件及其使用25. 基因工程相关的网站基因工程相关的网站26. 人类基因组计划（人类基因组计划（HGP）27. 基因工程产物的纯化策略（载体）基因工程产物的纯化策略（载体）28. 基因工程对中国经济的影响基因工程对中国经济的

5、影响30. 基因工程的社会安全及伦理问题基因工程的社会安全及伦理问题29. 发达国家中的基因工程发展及现状发达国家中的基因工程发展及现状31. 制作基因工程网站制作基因工程网站32. 目前流行的传染性疾病的基因工程治疗思考目前流行的传染性疾病的基因工程治疗思考33. 核糖体展示技术（核糖体展示技术（ribosome display）1.1 基因工程的发展简史DNA重组、扩增、表达重组、扩增、表达是其三要素。是其三要素。一、基因工程的概念一、基因工程的概念生物工程 biological engineering遗传工程 genetic engineering基因工程 gene engineerin

6、g分子克隆 molecular cloning基因克隆 gene cloning基因操作 gene manipulation重组DNA技术 recombinant DNA technique基因工程(gene engineering)常和以下名称混用:泛基因阶段1 顺反子阶段4 摩尔根的基因阶段3 孟德尔遗传因子阶段2 现代基因阶段 5基因基因的研究的研究Mendel G.J. (1822-1884). 1856-1864豌豆杂交实验。豌豆杂交实验。2. Mendel2. Mendel的遗传因子阶段的遗传因子阶段1866年发表论文，提出分离规年发表论文，提出分离规律和独立分配规律律和独立分配规

7、律1900年年Mendel遗传规律被重新遗传规律被重新发现。发现。遗传学的元年遗传学的元年Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。遗传因子是决定性状的抽象符号。孟德尔分离律孟德尔自由组合律 黄圆 绿圆 黄皱 绿皱1909年丹麦遗传学家年丹麦遗传学家Yohannsen (1859-1927)发表了发表了“纯系学说纯系学说”首首先提出了先提出了“基因基因(gene)”的概念，代替了的概念，代替了Mendel “遗传因子遗传因子” 的概念。的概念。但没有提出基因的物质但没有提出基因的物质概念。概念。3. Morgan的基因阶段的基因阶

8、段 显微镜技术与染色技术的发展，使人们注意到，细胞分裂时，尤其是减数分裂中，染色体的行为和孟德尔提出的等位基因的分离规律相当一致，所以，确定基因在细胞核中，在染色体上。1910年，年，Morgan T.H.等以果蝇为研究材料，提出了等以果蝇为研究材料，提出了基因的基因的连锁遗传规律连锁遗传规律。说明了基因是在染色体上占有。说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。内涵。连锁遗传规律的提出连锁遗传规律的提出1957年，本泽尔年，本泽尔(Seymour Benzer)以以T4噬菌噬菌体为材料，在体为材料，在DNA分子

9、水平上研究基因内部的精细分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（结构，提出了顺反子（cistron）概念。概念。 顺反子是顺反子是1个遗传功能单位，个遗传功能单位，1个顺反子决定个顺反子决定1条多肽链。条多肽链。 二、基因工程诞生的理论基础二、基因工程诞生的理论基础1 . DNA是遗传物质是遗传物质1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。（1）肺炎双球菌转化实验（2）噬菌体转染实验 1928年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。 （1）

10、S型：注射小白鼠，死亡。 （2）S型，65 加热：注射小白鼠，活。 （3）R型：注射小白鼠，活。 （4） 65 加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。 40年代，DNA是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。 （1） S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌； （2）经DNase 处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。 （3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。 不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命

11、性开端。1953年年James D. Watson和和Francis H. C. Crick揭示了揭示了DNA分子的分子的双螺旋结构双螺旋结构和和半保留复制机制半保留复制机制。2. DNA双螺旋结构双螺旋结构5050年代，年代，DNADNA的双螺旋模型的提出的双螺旋模型的提出和和DNADNA复制机理的阐明复制机理的阐明 DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。 1953年，Francis Crick和James Watson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，

12、DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。 分子遗传学的诞生分子遗传学的诞生1957年年Crick又提出了遗传信息传递的又提出了遗传信息传递的“中中心法则心法则” DNA RNA protein1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码3. 中心法则和遗传密码原核生物的基因调控操纵子模型原核生物的基因调控操纵子模型1961年，年，Jacques Monod和和 Fancois Jacob提出了原核基因调控的提出了原核基因调控的操纵子模型操纵子模型（operon model）。）。三、基因工程诞

13、生的技术突破三、基因工程诞生的技术突破1. 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonucleases）1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。Werner Arber 理论预见限制酶理论预见限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得用限制酶切得SV40 DNA片断片断Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶得到第一个限制酶1978年年Nobel生理或医学奖生理或医学奖2. DNA连接酶（连接酶（ligase）1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。3. 载体（载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作

14、载体。在细菌细胞里的大量扩增。4. 感受态体系感受态体系1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。5. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。6. DNA测序技术测序技术1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。1980年年Nobel化学奖化学奖四、基因工程的诞生四、基因工程的诞生1980年年Nobel化学奖化学奖1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组

15、实验：1. Berg的开创性实验的开创性实验将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。Stanley Cohen 1986 Nobel 生理生理或医学奖或医学奖Herb Boyer外源外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。和高水平表达。1. 跨物种性2

16、. 无性扩增外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。五、基因工程的特征五、基因工程的特征2. 重组体的制备六、基因工程的主要操作内容六、基因工程的主要操作内容1. 目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。4.克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。基因工程的基本流程基因工程的基本流程基因分基因分离酶切离酶切载体酶切载体酶切基因和载基因和载体连接体连接导入细菌导入细菌重组质粒繁殖

17、重组质粒繁殖重组克隆的选择重组克隆的选择序列分析和基序列分析和基因表达等研究因表达等研究导入导入植物植物细胞细胞51酶切酶切 连接连接载体目的基因重组子宿主细胞选择、筛选选择、筛选目的基因扩增目的基因扩增转化或转染转化或转染目的基因表达目的基因表达导入导入表达体系表达体系1.2 1.2 基因工程的兴起基因工程的兴起1977年，激素抑制素的发酵生产成功年，激素抑制素的发酵生产成功。1978年，年， Goeddel等，等，人胰岛素人胰岛素的发酵生产成功。的发酵生产成功。1979年，年， Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素人生长激素基因。基因。1980年

18、，年， Nagata等，等， 遗传工程菌生产遗传工程菌生产干扰素干扰素获得成功。获得成功。1981年，年， 用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫口蹄疫疫苗、疫苗、乙型肝乙型肝炎炎病毒表面抗原及核心抗原、病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素牛生长激素等。等。1982年，年， 重组重组DNA技术生产的药物技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产人胰岛素进入商品化生产。1983年，年， 基因工程生产基因工程生产狂犬病疫苗狂犬病疫苗取得突破型进展。取得突破型进展。1997年，动物基因工程产品销售额约年，动物基因工程产品销售额约1.8亿$转基因小鼠转基因小鼠人类秃顶人类

19、秃顶Nature Biotechnology, 1999,17(1):9转基因家蚕转基因家蚕防弹衣防弹衣Nature Biotechnology, 1999,17（5）：）：41283 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02FirsttransgenicplantDelay-ripening tomatoCommercialized in the USFirst field testsHerbicide resistant, insect resistant plants commercializedGM maize a

20、pproved by EU First Bt corn plants Rotting resistant tomato approved by FDA植物基因工程的发展迅速植物基因工程的发展迅速植物转基因育种的发展优势植物转基因育种的发展优势1、扩大了作物育种的基因库 2、提高了作物育种的效率 3、减轻了农业生产对环境的污染4、拓宽了作物生产的范畴 全球转基因作物种植面积（百万公顷）全球转基因作物种植面积（百万公顷） 全球转基因作物导入特性比例全球转基因作物导入特性比例 全球不同转基因作物和应用面积全球不同转基因作物和应用面积0816243219961997199819992000资料来源：注

21、释3全球转基因作物销售收入（亿美元）全球转基因作物销售收入（亿美元） 植物基因工程研究植物基因工程研究植物基因组计划植物基因组计划植物分子育种植物分子育种高产、优质、高效和多抗性高产、优质、高效和多抗性植物作为反应器植物作为反应器香蕉、马铃薯、番茄等香蕉、马铃薯、番茄等玉米、棉花、大豆、高粱和番茄玉米、棉花、大豆、高粱和番茄酒精、石油、工业酶等酒精、石油、工业酶等制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。1. 对环境的影响2. 新型病毒的出现重新组合一种在自然见尚未发现的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。一、基因工程的安全隐患一、基因工程

22、的安全隐患将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。4. 人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。3. 癌症扩散1. 公众的担忧公众的担忧二、重组DNA研究的安全准则1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚

23、重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。2. 专家的态度专家的态度3.制定安全规则1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。 1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。分4级：P1P4级。（1）实验室的物理安全4. 基因工程的安全措施一般装备良好的普通微生物实验室。 P1级实验室 P2 级实验室在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。全负压的实验室，同时装备安全操作柜。 P4级实验室专用的实验

24、大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。 具有最高安全防护措施。 P3 级实验室在自然环境中无法存活。（2）实验室的生物安全分3 级（大肠杆菌）：EK1EK3级。 EK1级的大肠杆菌在自然环境中一般都要死亡。 EK2-EK3级大肠杆菌第一个“安全”菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。（3） 载体的安全应该是失去了自我迁移的能力。不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。 （容易构建）。如pMB9，pBR322等。一、基因工程在农业生产中的应用一、基因工程在农业生产中的应用1. 提高植物的光合作用效率1.4 基因工程的应用基因工程的应用改变与光合作用有关的酶的结构和组改变与光合作用有

25、关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。（1）提高CO2的固定率改变光能交换系统的分子的基因结构。（2）提高光能吸收率和转化率使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。2. 提高豆科植物的固氮效率是农业生物技术的主要内容。 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。3. 转基因植物世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）转基因作物特性转基因作物特性批准项数批准项数所占比例所占比例抗除草剂抗除草剂129729.6%抗虫抗虫104623.8%产品质量高产品质量高88620.2%抗病毒抗病毒43

26、69.9%农学性状好农学性状好2114.8%抗真菌抗真菌2084.7%其它其它3036.9%中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）将外源基因导入动物细胞，并在基因组内将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。稳定整合，遗传给后代。 使动物成为使动物成为生物生物反应器反应器生产有用的活性蛋白等。生产有用的活性蛋白等。4. 转基因动物在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的转基因小鼠； 分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。转移大鼠生长素基因的小鼠未来可能出现的人造动物？未来可能出现的人造动物？二、基因工程在工业中的应用二、基因工程在工业中的应用克隆各种参与纤维素

27、降解的酶的基因，导入克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。葡萄糖，发酵成酒。用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。1. 纤维素的开发利用2. 酿酒工业三、基因工程在医药上的应用三、基因工程在医药上的应用1976年，年，27岁的风险投资人岁的风险投资人Robert Swanson与与University of California的教授的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因共饮了几杯啤酒，讨论了基

28、因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。）。第一个基因工程公司在学术界和商业界第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！的满腹怀疑中诞生了！Genentech的骄人业绩1976Genentech创立创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素基因克隆了人生长激素基因1980公司上市，募集公司上市，募集

29、$ 35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）公司）1984第一个第一个VIII因子，转让给因子，转让给Cutter Biological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（生产组织纤溶酶原激活剂（TPA）1990生产生产interferon 1 1990与瑞士与瑞士Roche医药公司合并（医药公司合并（$ 2.1billion）制造新型疫苗（如制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、乱、痢疾、SARS）2. 用微生物生产药物3. 技术设计高效高特异性的生物制剂4. 研制疫苗1. 用转基因植物或动物生产药物大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）6. 法医鉴定7.基因治疗5. 基因诊断将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞