Primer5设计引物------图文并茂一步步教你

1、1、打开后的界面如图。2、点 FILE-NEW DNA SEQUENCE 女口图M313lk*氏晳I匸!Ml典FK*vJJIhll皿Prg2g EJ斑a蠢位|樹萼疇驗欖1魄虹型BM昱| 夺-4 ISlft!:笄3、输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。4、此主题相关图片如下：选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏此主题相关图片如下：选中 0K键，5、分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位

2、点时就应排除这些酶此主题相关图片如下:5、分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶此主题相关图片如下:filt T'odtx Ti 胡九豪歼刪w Q J加H反I打6、选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。此主题相关图片如下:7、软件默认引物为二五个碱基此主题相关图片如下7、软件默认引物为二五个碱基此主题相关图片如下8、可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7-9个碱基，保留16- 18个配对即可 此主题相关图片如下：9、在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入 HIND III酶切位点及TTA保护碱基，完成后点

3、analyze，认为可以后点 0K。此主题相关图片如下：10、选中左上角 A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。11、从3端删除7-9个碱基同正义链。此主题相关图片如下:12、将酶切位点加在 5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。完成后点analyze,认为可以后点 0K。 此主题相关图片如下：內m环00 Select:T CJULACTUT ASMEJlI fris<T三门和帀佛|/ OK卍右予Jl A_#4：t»in .寸：耐 J| a oh:St|13、最后分析结果如图，反义链的FAL

4、SE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也 可以不考虑，主要看 Tm值正义链和反义链相差不应超过 3度。GC含量不应超过60%此主 题相关图片如下：14、该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印 此主题相关图片如下:15、如果设计RT-PCR检测的引物 就如下所示，同上输入目的基因片段， 选SEARCH图标， 选择参数，一般选 PCR primers-both 100 至 250 个碱基，引物长短 20 +1-2, search parametere 中的参数可以不选，为默认设置。点 0K。此主题相关图片如下：16、显示满足设计参数的候选结果，点OK.此主题相关图片如下:

5、“Ct tolKt紅氏屛tn却韋SennAnflii xmie犀osPi M-nr i;EEI JTTAAA«T1西s回匚国$enw11真諮轧.I己疋 琴出*传T三.士更1_1耶逬)C*ncflvwMi兮PSDatet j isPt>*4 HWIEinfNwcy:EMl17、点SENES选择正义链，RATING表示引物评分，最好选评分高的。此主题相关图片如 下：18、点ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。整个一队引物评价同目的基因克隆的引物设计 相同此主题相关图片如下:/ Fr >a<£ Fs3" CrTJLCTTTMTG匚£11

6、：匸&5'I I I It H I I I I I I I I I H I tCTGTCI7rM«TTCULCCi.GG.lT CLtLlGJLCCCrTGJLGCTCCAQJLGATCTGrrJLA-CT CJLAACCCGGCTA-TC&CAC 匚匸匚石松 'l£±iO " IJl A ft12-io"'VWtaBQL«og*liTm. rnGC哥Aciiwv'S#nM-*11tw*f3'PtrQdyl99»i»jfi 4.J!-'DI xj4* Arrii vvinwQiSennaihoiiNoho竺®兰Je:Cr9««DirrmManeIfvin?Scq hksLefilh1am IFGC%De|ET-iEr *