MALDITOFMS在细菌检测中的应用学习教案

1、会计学1MALDITOFMS在细菌在细菌(xjn)检测中的应用检测中的应用第一页，共54页。2第1页/共53页第二页，共54页。3第2页/共53页第三页，共54页。n虽然某些生化试验只需要数分钟即可完成，但对于绝大多数经过转种、培养的微生物标本，通常要得到一个完整的鉴定报告大约要24-48h，某些苛氧菌或生长慢的细菌则耗时更多。n操作繁琐、主观性强。4第3页/共53页第四页，共54页。具有高度稳定性、易于提取和分析而成为理想的细菌鉴定的研究对象。n通过分析比较细菌rRNA序列的相关性确定细菌种系的发生关系。5第4页/共53页第五页，共54页。n技术复杂、耗费高、假阳性率高、不能自动化、高通量。

2、n不适合临床常规检测！6第5页/共53页第六页，共54页。迫切需要找到一种新的病原微生物快速诊断(zhndun)的方法，以满足临床需要7第6页/共53页第七页，共54页。8第7页/共53页第八页，共54页。9第8页/共53页第九页，共54页。恰好是另一种核素质量的整数倍。n分析这些离子可获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律等信息。10第9页/共53页第十页，共54页。n速度慢的离子在磁场中偏转较大，速度快的偏转小n在磁场中还能发生质量的分离，使不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到(d do)质谱图，从而确定其质量。11第10页/共53页第十一页，共54页。n有单聚焦质谱计、

3、双聚焦质谱计和四极矩质谱计等。n后两种用得较多，而且多与气相色谱仪和电子计算机联用。12第11页/共53页第十二页，共54页。能维持10-7 10-8毫米汞柱的真空度。13第12页/共53页第十三页，共54页。口引入。n液相色谱/质谱接口有传动带接口、直接液体接口和热喷雾接口。14第13页/共53页第十四页，共54页。（desorption ionization）和快原子轰击电离等。n其中场解吸和快原子轰击特别适合测定挥发性小和对热不稳定的化合物。15第14页/共53页第十五页，共54页。16第15页/共53页第十六页，共54页。n对于(duy)微量不纯的化合物，可以利用气相色谱或液相色谱（对

4、极性大的化合物）将化合物分离成单一组分，导入质谱计，录下质谱图。17第16页/共53页第十七页，共54页。大简化了操作手续。n质谱法特别是它与色谱仪及计算(j sun)机联用的方法，已广泛应用在有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。18纯化纯化(chn hu)离子离子(lz)分离分离分析分析第17页/共53页第十八页，共54页。用LC-MS分析，此时主要得到分子量信息，如果是串联质谱，还可以得一些结构信息。n如果是生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要获得分子量信息。对于蛋白质样品，还

5、可以测定氨基酸序列。19第18页/共53页第十九页，共54页。20第19页/共53页第二十页，共54页。21质谱的基本概念质谱仪第20页/共53页第二十一页，共54页。22第21页/共53页第二十二页，共54页。库或与已知微生物的质谱峰比较，来实现对微生物的快速鉴定具有快速、高灵敏度、高分辨率等优点，能够(nnggu)对核酸、蛋白质和多肽等生物大分子进行微量分析.23第22页/共53页第二十三页，共54页。再用一定波长的脉冲式激光进行照射，基质吸收激光能量后，均匀地传递给待分析物，使待分析物瞬间气化(q hu)并离子化。使用基质的主要目的是保护待分析物不会因为过强的激光能量导致化合物被破坏。2

6、4第23页/共53页第二十四页，共54页。的离子飞行时间短而首先到达检测器。25第24页/共53页第二十五页，共54页。c)。即通过测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来检测(jin c)离子的分子量通过专用软件分析比较，确定出特异性的指纹图谱26第25页/共53页第二十六页，共54页。27MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 原理图原理图基质辅助激光(jgung)解吸电离飞行时间质谱第26页/共53页第二十七页，共54页。28第27页/共53页第二十八页，共54页。白质组指纹图，通过特征性的模式(msh)峰进行菌株的鉴定。29MALDI-TOF-MS在临床(ln c

7、hun)微生物中的应用第28页/共53页第二十九页，共54页。30MALDI-TOF-MS在临床(ln chun)微生物中的应用第29页/共53页第三十页，共54页。n类可能类可能影响质影响质谱峰的谱峰的形成。形成。n有研究有研究表明，表明，DHB 50 mg/mL，31 50%乙腈，0.1%三氟乙酸为基质，检测液体培养(piyng)细菌，可获得最佳质谱图。 现已有商品化的配套基质溶液可以购买。MALDI-TOF-MS在临床(ln chun)微生物中的应用第30页/共53页第三十一页，共54页。临床标本接种于培养基（液体临床标本接种于培养基（液体或固体）或固体）挑取菌落或取液体培养液，经挑取菌

8、落或取液体培养液，经水和乙醇处理水和乙醇处理再经再经70%70%甲酸甲酸/ /乙腈（乙腈（1 1：1 1）处）处理理32MALDI-TOF-MS在临床(ln chun)微生物中的应用第31页/共53页第三十二页，共54页。式式(msh)(msh)、加速电压、激加速电压、激光强度等参数光强度等参数还未获得一个还未获得一个统一的模式统一的模式(msh)(msh)，需，需要优化。要优化。33MALDI-TOF-MS在临床(ln chun)微生物中的应用Ekin=1/2mV2第32页/共53页第三十三页，共54页。*横坐标为质荷比（m/z），纵坐标为吸收(xshu)峰强度34MALDI-TOF-MS在

9、临床(ln chun)微生物中的应用第33页/共53页第三十四页，共54页。35MALDI-TOF-MS在临床(ln chun)微生物中的应用简要操作简要操作(cozu)流程流程第34页/共53页第三十五页，共54页。36（二）（二）MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS在细菌检验在细菌检验(jinyn)(jinyn)中的应用范围中的应用范围细菌菌种鉴定(jindng)多血清型细菌鉴定(jindng)耐药性不同的菌株鉴定(jindng)真菌的鉴定(jindng)血液、尿液及其他无菌液体标本的鉴定(jindng)粪便标本的鉴定(jindng)第35页/共53页第三十六页，共54页。Bi

10、zzini等分析等分析1371株临床分离株临床分离(fnl)株发现株发现93.2%能鉴定到能鉴定到种水平，种水平，5.3%到属水平。在到属水平。在鉴定到种的水，鉴定到种的水，MS和传统生和传统生化方法平一致率为化方法平一致率为95.1%。37第36页/共53页第三十七页，共54页。结论：结论：MALDI-TOF-MS能准确、可重能准确、可重复地鉴定细菌且在复地鉴定细菌且在10min内，内，不需要其他的耗材。不需要其他的耗材。结果错误或不能鉴定是由于结果错误或不能鉴定是由于MALDI-TOF-MS数据库不完数据库不完善，大部分的差异是因为系善，大部分的差异是因为系统数据库相关的分类学差异。统数据

11、库相关的分类学差异。38第37页/共53页第三十八页，共54页。应用应用MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS技术对这些技术对这些多血清型细菌进行鉴定和分多血清型细菌进行鉴定和分类得到了初步应用，在沙门类得到了初步应用，在沙门氏菌分型中表现出较好的分氏菌分型中表现出较好的分型能力。型能力。39第38页/共53页第三十九页，共54页。（MRSAMRSA）可以用可以用MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS检测针对检测针对抗菌剂分子的细菌各种获得抗菌剂分子的细菌各种获得性酶，如性酶，如-内酰胺酶、甲基内酰胺酶、甲基化酶、质子泵等。化酶、质子泵等。40第39页/共53页第四十页，共

12、54页。标本，标本，MSMS直接鉴定直接鉴定79%79%的单的单一细菌感染。一细菌感染。MSMS对尿液标本中的细菌快速、对尿液标本中的细菌快速、准确，尤其是大肠埃希菌，准确，尤其是大肠埃希菌，正确鉴定率为正确鉴定率为97.6%97.6%。也有研究应用也有研究应用MSMS直接检测和鉴直接检测和鉴定其他正常无菌液体中的细定其他正常无菌液体中的细菌，正确鉴定率为菌，正确鉴定率为96% 96% 。41第40页/共53页第四十一页，共54页。根菌等做出准确根菌等做出准确(zhnqu)(zhnqu)判定。判定。42第41页/共53页第四十二页，共54页。43第42页/共53页第四十三页，共54页。取取1m

13、L1mL培养液培养液 6000 6000g g离心离心3min3min收集菌体收集菌体, ,用用75%75%乙醇溶液灭活乙醇溶液灭活, ,离心去上清。离心去上清。用超纯水将菌体洗涤用超纯水将菌体洗涤2 2次次, ,最后用最后用1mL1mL超纯水重悬菌体。超纯水重悬菌体。取取1L1L细菌细菌(xjn)(xjn)重悬液与重悬液与1L1L基质溶液充分混合后点样基质溶液充分混合后点样, ,室温干燥。室温干燥。44MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 应用应用(yngyng)(yngyng)举例举例第43页/共53页第四十四页，共54页。物对系统进行物对系统进行(jnxng)(jnxng)

14、校正校正, ,使误差使误差0.1%.0.1%.4.4.数据分析数据分析通过通过FlexAnalysis3.0FlexAnalysis3.0软件处理软件处理质谱图质谱图, ,包括质谱图的平滑、包括质谱图的平滑、衰减及标峰处理衰减及标峰处理( (信噪比大于信噪比大于5)5)。通过通过ClinProToolTM 2.1ClinProToolTM 2.1软件进软件进行行(jnxng)(jnxng)主成分分析。主成分分析。45MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 应用应用(yngyng)(yngyng)举例举例第44页/共53页第四十五页，共54页。46a：大肠杆菌(d chn n jn)

15、；b：志贺氏菌；c：副伤寒沙门氏菌MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 应用应用(yngyng)(yngyng)举例举例第45页/共53页第四十六页，共54页。47AB大肠(dchng)埃希菌志贺氏菌副伤寒沙门氏菌(sh mn sh jn)混合菌群第46页/共53页第四十七页，共54页。48第47页/共53页第四十八页，共54页。受样本中杂质的影响较小受样本中杂质的影响较小无需预先无需预先(yxin)(yxin)培养或分离，培养或分离，可直接进行检测可直接进行检测49MALDI-TOF-MS方法学评价(pngji)第48页/共53页第四十九页，共54页。方法的准确性依赖于数据库中

16、菌方法的准确性依赖于数据库中菌种的信息量，目前国内菌种数种的信息量，目前国内菌种数据库中的质谱分析据库中的质谱分析(fnx)(fnx)图图谱量较少，限制了检测的准确谱量较少，限制了检测的准确性性50MALDI-TOF-MS方法学评价(pngji)第49页/共53页第五十页，共54页。技术应用的准确性。技术应用的准确性。该技术对不同菌株的检测灵敏该技术对不同菌株的检测灵敏度和准确性、多血清型细菌度和准确性、多血清型细菌的分型鉴别准确性以及样品的分型鉴别准确性以及样品处理、质谱图采集和分析等，处理、质谱图采集和分析等，还有许多问题需要研究和改还有许多问题需要研究和改进。在试验方法的标准化方进。在试验方法的标准化方面也需要深入探讨。面也需要深入探讨。51MALDI-TOF-MS方法学评价(pngji)第50页/共53页第五十一页，共54页。52第51页/共53页第五十二页，共54页。第52页/共5