ELISA和ELISPOT检测技术

1、ELISA与与ELISPOT检测技术检测技术酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫斑点试验（酶联免疫斑点试验（ELISPOT）酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 (ELISA)ELISA技术简介技术简介ELISA的基本原理的基本原理ELISA的类型和方法的类型和方法ELISA方法注意事项和应用方法注意事项和应用酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原基于抗原-抗体反应的抗体反应的特异性特异性和和等比例性等比例性，是酶免疫测定技，是酶免疫测定

2、技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附（包被包被）在固相载体）在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生颜色反应颜色反应，通，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色反应过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色反应的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术的深浅检测标

3、本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。 ELISA的发展概况的发展概况 自从自从Engvall和和Perlman（瑞典，（瑞典，1971）首次报道建立酶联免）首次报道建立酶联免疫吸附试验（疫吸附试验（ELISA）以来，由于）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、技术具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的检测技术

4、的特异性，加之电脑化程度极高的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。测方法之一。 目前，目前，ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫、检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫、环境监测等诸多领域广泛应用。环境监测等诸多领域广泛应用。ELISA的基本原理的基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可体的免疫学特性，也

5、不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现有色的氧化型，出现颜色反应颜色反应。因此，。因此，可通过底物的颜色反应来可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比抗原的量呈正比。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定，。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定

6、，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 基本原理基本原理ELISA试剂盒的组成试剂盒的组成完整的完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分：试剂盒通常包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板酶标板）；）；（2）酶酶标记的抗原或抗体（标记的抗原或抗体（酶标记物酶标记物）；）；（3）酶的）酶的底物底物；（4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液；）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液；（

7、5）酶标记物及样本的稀释液；）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）；）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）；（7）反应终止液；）反应终止液；（8）封口膜若干、说明书一份。）封口膜若干、说明书一份。酶标板酶标板ELISA常用酶类常用酶类辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)DH2+ H2O2 D + H2O上式中，上式中，DH2为供氢体，为供氢体，H2O2为受氢体。为受氢体。常用底物常用底物： 1. 邻苯二胺邻苯二胺(OPD)，产物为，产物为橙红色橙红色（492nm检测检测）；）； 2. 四甲基联苯胺四甲基联苯胺(

8、TMB)，产物为，产物为蓝色蓝色，酸性条件下变为，酸性条件下变为 黄色黄色（450nm检测检测）。）。反应终止液：反应终止液：HCl或或H2SO4溶液。溶液。碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)常用底物常用底物： 1. 对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为，产物为黄色的对硝基酚黄色的对硝基酚 （405nm检测）；检测）； 2. 发荧光底物（磷酸发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于荧光测定，甲基伞酮），可用于荧光测定，灵敏度高于显色底物的方法。灵敏度高于显色底物的方法。反应终止液：反应终止液：NaOH 溶液。溶液。ELISA所需仪器设备所

9、需仪器设备恒温箱恒温箱洗板机洗板机酶标仪酶标仪ELISA的类型和方法的类型和方法半定量半定量ELISA试验试验定量定量ELISA试验试验试验目的试验目的试验性质试验性质间接法间接法双抗夹心法双抗夹心法 (直接夹心法直接夹心法)BAS-ELISA双夹心法双夹心法 (间接夹心法间接夹心法)竞争法竞争法ELISA直接法直接法 直接法直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物，抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量测定产物的吸光

10、值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量（见后图）（见后图） 。该方法可用于检测抗体或抗原。该方法可用于检测抗体或抗原。 直接法直接法ELISA优点优点: 1. 特异性高、准确性好；特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。实验操作简便，用时短。缺点缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。应用范围较小，生产难度大。 需制备各种酶标抗原或抗体。需制备各种酶标抗原或抗体。间接法间接法ELISA 间接法间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成抗原在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和抗体复合物后，再

11、以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。 该方法可用于抗体检测该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的是目前检测抗体最常用的ELISA方方法。法。优点优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价格便宜。制备方便，价格便宜。双抗夹心法双抗夹心法ELISA 双抗夹心法双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获是先将未标记的抗体包被在酶标

12、板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原抗原-酶标抗体复合酶标抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量，物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量，本方法也称为本方法也称为直接夹心法直接夹心法（见后图）（见后图） 。 该方法可用于抗原检测，该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细例如细胞因子、激素、蛋白质、细菌、病毒等，菌、病毒等，是目前检测抗原最常用的是目前检测抗原最常用的ELISA方法。方法。优点优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2

13、. 制备方便，价格便宜。制备方便，价格便宜。双夹心法双夹心法ELISA 双夹心法双夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体原，然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原抗原-未标记抗体未标记抗体复合物；再应用酶标二抗和抗体复合物；再应用酶标二抗和抗体-抗原抗原-未标记抗体复合物结合，未标记抗体复合物结合，形成抗体形成抗体-抗原抗原-未标记抗体未标记抗体-酶标二抗复合物，也称为酶标二抗复合物，也称为间接夹心法间接夹心法（见后图）。（见后图）。 该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。该方法可用于抗原

14、检测，例如蛋白质、病原体等。优点优点: 1. 灵敏度高。灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。缺点缺点: 实验操作较复杂。实验操作较复杂。BAS-ELISA BAS-ELISA即生物素即生物素-亲和素系统（亲和素系统（biotin avidin system, BAS）ELISA法：法：是先将抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，是先将抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，然后用生物素（然后用生物素（biotin）标记的抗体与抗原反应形成抗体）标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原抗原-生物素标记抗体复合物，再依次加入亲和素、酶标记生物素（或生物素标记抗体复

15、合物，再依次加入亲和素、酶标记生物素（或直接加入酶标记的亲和素），最后加底物显色。直接加入酶标记的亲和素），最后加底物显色。 生物素生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅酶酶R或维生素或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度亲和力，即一个亲和素可以结合亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子个生物素分子。因此，。因此，本方法本方法具有信号放大功能（特点）具有信号放大功能（特点）。 该方法可用于抗原、抗体以及该方法可用于抗原、抗体以及DNA和和RNA（生物素）检测。（生物素）检测。B

16、AS-ELISA实验原理实验原理竞争法竞争法ELISA 竞争法竞争法ELISA的实验原理的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分：将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物（酶标抗原）和酶标记物（酶标抗原）；在；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检测定孔中同时加入酶标抗原和待检样本（抗原），样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶

17、标抗原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈

18、现的色泽成正比，用分定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。而进一步得知样本中抗原的多少。测测定孔定孔EEEEE酶标记物底物溶液对照孔对照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶标记物底物溶液参考液(不含抗原)EE样本(含抗原)竞争法竞争法ELISA实验原理实验原理半定量半定量ELISA试验试验间接法检测血清间接法检测血清HBsAb含量含量设计加板次序设计加板次序(空孔、阴、阳空孔、阴、阳)加板加板(阴、阳、样阴、阳、样)37, 30min加酶

19、标抗体加酶标抗体(空孔除外空孔除外)洗涤洗涤3次，拍干次，拍干加底物溶液加底物溶液(空孔除外空孔除外)37, 10-30min加终止液加终止液(空孔除外空孔除外)避光避光上机检测、结果判定上机检测、结果判定(空孔调零空孔调零)37, 30min洗涤洗涤3次，拍干次，拍干双抗夹心法检测血清双抗夹心法检测血清IL-2含量含量设计加板次序设计加板次序(空孔、阴、阳、标准空孔、阴、阳、标准)加板加板(阴、阳、标准、样阴、阳、标准、样)37, 30min加酶标抗体加酶标抗体(空孔除外空孔除外)洗涤洗涤3次次, 拍干拍干加底物溶液加底物溶液(空孔除外空孔除外)37, 10-30min加终止液加终止液(空孔

20、除外空孔除外)避光避光上机检测、绘制标准曲线上机检测、绘制标准曲线(空孔调零空孔调零)从标准曲线上从标准曲线上读取样品含量读取样品含量37, 30min洗涤洗涤3次次, 拍干拍干ELISA试验中的注意事项试验中的注意事项必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验试剂盒的质量；试剂盒的质量；待测样品应设立双复孔或三复孔；待测样品应设立双复孔或三复孔；半定量（或定性）半定量（或定性）ELISA中结果判断依据通常为：中结果判断依据通常为：OD样样/OD阴阴2.1时为阳性结果，时为阳性结果，2.1时为阴性时为阴性；酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免

21、假阳性；酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性；定量定量ELISA中中每一批次每一批次的试剂盒必须的试剂盒必须绘制一个标准曲线绘制一个标准曲线；定量定量ELISA中还应特别注意中还应特别注意试剂盒的灵敏度试剂盒的灵敏度(测定范围测定范围)。ELISA试验的应用试验的应用抗体及抗体亚类检测（包括血清、制备的抗体溶液等）抗体及抗体亚类检测（包括血清、制备的抗体溶液等）抗原检测（包括制备的抗原、毒素、病原体等）；抗原检测（包括制备的抗原、毒素、病原体等）；激素及其他生物活性分子检测（如激素及其他生物活性分子检测（如HCG检测等）；检测等）；细胞因子及其受体检测（人、小鼠、大鼠等来源）；细胞因子及其受体

22、检测（人、小鼠、大鼠等来源）；BAS-ELISA还可用于核酸（还可用于核酸（DNA/RNA）检测；）检测；酶联免疫斑点试验（酶联免疫斑点试验（ELISPOT）ELISPOT技术简介技术简介ELISPOT的基本原理的基本原理ELISPOT的实验方法的实验方法ELISPOT技术的应用技术的应用ELISPOT技术简介技术简介 酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使使体外检测各种体外检测各种细胞因子细胞因子及及抗体抗体研究

23、有了新的突破。在研究免疫研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时，以往常用应答机制时，以往常用ELISA方法方法检测体液中游离的细胞因子检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的）或抗体，但由于游离的CK或循环抗体的半哀期不同，或循环抗体的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反不能确切的反映体内的抗体及映体内的抗体及CK 的水平的水平。80 年代，国外的科研工作者根据年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和和 CK 分泌

24、细胞的固相酶联免疫斑点技术（分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。 ELISPOT的发展概况的发展概况Sedgwich JD (澳大利亚澳大利亚)和和Czerkinsky CC (瑞典瑞典)等人几乎同等人几乎同时在时在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。细胞频率。 底板材料的发展底板材料的发展：普通塑料板：普通塑料

25、板(1983) 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜 (NC膜膜, 1985) 聚偏二氟乙烯膜聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜膜) 透明板透明板(1997, 荷兰荷兰U-Cytech公司公司)抗体制备技术的发展抗体制备技术的发展：上世纪：上世纪90年代后抗体制备技术提升。年代后抗体制备技术提升。检测内容的发展检测内容的发展：由：由抗体检测抗体检测向向细胞因子检测细胞因子检测。发展趋势发展趋势：1. 多种细胞因子在同一孔板中同时检测。多种细胞因子在同一孔板中同时检测。 2. 试验操作的标准化、规范化。试验操作的标准化、规范化。ELISPOT的技术特点的技术特点灵敏度高灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细

26、胞因子：在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。是目前最为灵敏的阳性细胞即可被检测出来。是目前最为灵敏 的检测技术，的检测技术，灵敏度灵敏度比传统的的比传统的的ELISA方法高方法高2-3个数量级个数量级 。 单细胞水平，活细胞功能检测单细胞水平，活细胞功能检测 ：检测的是单个活细胞分泌：检测的是单个活细胞分泌功能，而非细胞群体的功能，而非细胞群体的 平均分泌功能。平均分泌功能。 操作简便经济，可以进行高通量筛选操作简便经济，可以进行高通量筛选 ：没有复杂的细胞体：没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪外扩增过程，不使用同位素，不需要大

27、型的、专门的实验仪器设备。按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理器设备。按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样数百个样 品，效率远远高于其它检测方法品，效率远远高于其它检测方法 。ELISPOT的基本原理的基本原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如的二抗结合，其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶碱性磷酸酶）的亲和素结）的亲和素结合。底物（合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）孵育后，产物为蓝紫色）孵育后，PVDF 孔板孔板出现出现