蛋白质的提取.PPT

1、1 提取通常是指用适当的溶剂和方法，提取通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。从原料中把有效成分分离出来的过程。 （三）蛋白质的提取和分离纯化（三）蛋白质的提取和分离纯化2 大多数蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸、稀蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶液。部分与脂类结合的蛋白质可碱的水溶液。部分与脂类结合的蛋白质可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。3 1.1.水溶液提取水溶液提取 稀盐稀盐(0.15mol/L)(0.15mol/L)和缓冲溶液对蛋白质溶解和缓冲溶液对蛋白质溶解度大度大, ,稳定性好稳定性好, ,是常用的蛋白质提取是常用的蛋白

2、质提取液液.5.5C C以下操作以下操作, ,防止热变性防止热变性. . 同时加蛋白质水解酶抑制剂同时加蛋白质水解酶抑制剂- -碘乙酸碘乙酸 控制控制pHpH在等电点附近在等电点附近. .4 2.有机溶剂提取有机溶剂提取 与脂类结合的蛋白质与脂类结合的蛋白质, ,分子中含有非极性侧链分子中含有非极性侧链的蛋白质不溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶的蛋白质不溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶液液, ,但可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。但可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。 3.3.表面活性剂提取表面活性剂提取 用非离子型表面活性剂可以提取水盐系列无法用非离子型表面活性剂可以提取水盐系列无法提取的蛋白

3、质和酶提取的蛋白质和酶, ,但随后分离困难但随后分离困难, ,要小心使要小心使用用. .5蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化p218 如测单一结构蛋白，则必须分离纯化。如测单一结构蛋白，则必须分离纯化。 为了研究某一个蛋白质的结构，必须首先为了研究某一个蛋白质的结构，必须首先将该蛋白质将该蛋白质 从其他蛋白质和非蛋白质分子从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。用于分离蛋白质的最重要特中纯化出来。用于分离蛋白质的最重要特性有性有大小、电荷、疏水性大小、电荷、疏水性和对其他分子的和对其他分子的亲和性亲和性。通常采用多种方法的组合来实现。通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化蛋白质的完全纯化 .

4、 .6纯化方法（见218226） 1. 沉淀法沉淀法 2. 色谱法色谱法 3. 电泳法电泳法 4. 离心法离心法 5. 膜分离法膜分离法 6. 双水相系统萃取法双水相系统萃取法71.沉淀法沉淀法 盐析法、盐析法、PEG沉淀法、等电点沉淀法、有沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、热处理沉淀法机溶剂沉淀法、热处理沉淀法8 （1）盐析法）盐析法 蛋白质水溶液加入盐的浓度对蛋白质的溶蛋白质水溶液加入盐的浓度对蛋白质的溶解度有显著影响解度有显著影响. 低浓度的盐能增加对蛋白低浓度的盐能增加对蛋白质的溶解度质的溶解度,称为称为盐溶盐溶; 当盐的浓度增加时当盐的浓度增加时,蛋白质的溶解度下降并析出蛋白质的

5、溶解度下降并析出,称为称为盐析盐析.这是这是由于高浓度的盐离子易与水结合由于高浓度的盐离子易与水结合,夺取了蛋夺取了蛋白质的水化层白质的水化层,使蛋白失水使蛋白失水,凝聚并沉淀析出凝聚并沉淀析出 不同蛋白质盐析所需的离子强度不同，盐不同蛋白质盐析所需的离子强度不同，盐析法就是建立于此的分离方法。析法就是建立于此的分离方法。910 盐析时常用的盐是硫酸铵盐析时常用的盐是硫酸铵, ,它溶解度大它溶解度大(515g/L),(515g/L),应应用范围广用范围广, ,不易引起蛋白质变性不易引起蛋白质变性. .血浆中蛋白质盐析的例子血浆中蛋白质盐析的例子硫酸铵浓度硫酸铵浓度 沉淀的蛋白质沉淀的蛋白质 占

6、总蛋白质的比例占总蛋白质的比例g/100mL %g/100mL % 20 20 纤维蛋白纤维蛋白 4 428-3328-33 优球蛋白优球蛋白 3 3 40-4640-46 假球蛋白假球蛋白 24245050以上以上 清蛋白清蛋白 6969盐析沉淀后的蛋白质需要用透析法脱盐盐析沉淀后的蛋白质需要用透析法脱盐11 （2）PEG法法 聚乙二醇是水溶性非离子型聚合物，记做聚乙二醇是水溶性非离子型聚合物，记做PEG-XX. XX表示平均分子量，越高的粘度越大，沉淀表示平均分子量，越高的粘度越大，沉淀蛋白质所需用量越少，但低分子量蛋白质所需用量越少，但低分子量PEG选择性更选择性更强。强。 沉淀相关因素

7、：沉淀相关因素：PEG的聚合度、的聚合度、PEG浓度、蛋白浓度、蛋白质分子量、蛋白质浓度、介质质分子量、蛋白质浓度、介质pH值、介质离子强值、介质离子强度、温度。度、温度。 PEG易吸收水分，是沉淀机理。易吸收水分，是沉淀机理。12 （3）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法 有机溶剂的加入使介质的介电常数下降，使蛋白有机溶剂的加入使介质的介电常数下降，使蛋白质分子间静电作用力增强；同时有机溶剂还可降质分子间静电作用力增强；同时有机溶剂还可降低蛋白质分子表面的水合程度，从而导致沉淀。低蛋白质分子表面的水合程度，从而导致沉淀。常用有机溶剂是乙醇和丙酮。常用有机溶剂是乙醇和丙酮。 有机溶剂能使蛋白质变性

8、，一般低温下操作，加有机溶剂能使蛋白质变性，一般低温下操作，加入适量中性盐。入适量中性盐。 某些金属离子可使蛋白质在有机溶剂中溶解度降某些金属离子可使蛋白质在有机溶剂中溶解度降低。低。13 （4）等电点沉淀法）等电点沉淀法 蛋白质在水溶液中一般以离子态溶于水蛋白质在水溶液中一般以离子态溶于水,在等电点在等电点时电荷为零时电荷为零, 消除了分子间的静电斥力，但由于消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是

9、用于沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。去除等电点相距较大的杂蛋白。 此时蛋白质沉淀析出此时蛋白质沉淀析出.不同的蛋白质等电点不同不同的蛋白质等电点不同,据此可对蛋白质提取物进行初步分离据此可对蛋白质提取物进行初步分离.14 （5）热变性沉淀）热变性沉淀 多数蛋白质都易热变性，所以可通过加热使杂蛋多数蛋白质都易热变性，所以可通过加热使杂蛋白变性沉淀而被除去，用于纯化热稳定酶。白变性沉淀而被除去，用于纯化热稳定酶。152.色谱法色谱法 常用的有：排阻色谱、离子交换色谱、亲常用的有：排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、经典的吸附色谱等。和色谱、疏水色谱、经

10、典的吸附色谱等。16 （1）凝胶过滤色谱）凝胶过滤色谱 Sephadex 交联交联葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 缓冲液中加盐防蛋缓冲液中加盐防蛋白吸附白吸附 Bio-Gel Bio-Gel 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 可分辨分子量只相差可分辨分子量只相差5000Da5000Da的蛋白质的蛋白质 Sepharose Sepharose 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 湿态提供湿态提供 Fractogel TSK Fractogel TSK 合成的亲水乙烯基凝胶过滤材料合成的亲水乙烯基凝胶过滤材料17凝胶过滤色谱的流动相 使用以水做基体具有不同使用以水做基体具有不同pH值的多种缓冲值的多种缓冲溶液做流动相。溶液做

11、流动相。 流动相中加入少量无机盐，维持流动相的流动相中加入少量无机盐，维持流动相的离子强度为离子强度为0.1-0.5，以消除体积排阻色谱，以消除体积排阻色谱法中不希望存在的吸附作用与基质的疏水法中不希望存在的吸附作用与基质的疏水作用。作用。18体积排阻色谱的影响因素 填料。化学键合的硅胶和亲水树脂凝胶。填料。化学键合的硅胶和亲水树脂凝胶。 柱长。分离度与柱长的平方根成正比。柱长。分离度与柱长的平方根成正比。60120cm对于蛋白质的分离比较理想。对于蛋白质的分离比较理想。 洗脱液。洗脱液。pH值接近中性值接近中性 流速。小于流速。小于0.1ml/min 样品容量。样品浓度样品容量。样品浓度0.

12、010.5%;蛋白质样蛋白质样品体积为柱体积的品体积为柱体积的13 蛋白质在变性洗脱条件下的分离蛋白质在变性洗脱条件下的分离19 （2）离子交换色谱）离子交换色谱 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素在蛋白葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素在蛋白质纯化中最常用。前二者交换容量大。质纯化中最常用。前二者交换容量大。 二乙基氨基乙基（二乙基氨基乙基（DEAE）常用于分离中）常用于分离中性或酸性蛋白质。高于性或酸性蛋白质。高于pH值为值为9时，需用时，需用三乙基氨基乙基（三乙基氨基乙基（TEAE）。中性或碱性蛋）。中性或碱性蛋白质常用羧甲基纤维素（白质常用羧甲基纤维素（CM）色谱分离。）色谱分离。低于低于pH

13、值为值为3时，需用磺酸乙基（时，需用磺酸乙基（SE）或）或磺酸丙基（磺酸丙基（SP）基团。）基团。20离子交换色谱的流动相 多以水溶液为流动相多以水溶液为流动相 组分的保留值和分离度主要是通过控制流组分的保留值和分离度主要是通过控制流动相的动相的pH值和离子强度来调节的值和离子强度来调节的 增加流动相中盐的浓度，组分的保留值降增加流动相中盐的浓度，组分的保留值降低。低。 离子交换色谱中，常用离子交换色谱中，常用NaNO3来控制流动来控制流动相的离子强度。相的离子强度。21离子交换色谱的影响因素 填料孔径的影响。高效离子交换色谱采用填料孔径的影响。高效离子交换色谱采用大孔径填料。大孔径填料。 柱

14、长。对分离度影响小。柱长。对分离度影响小。 流速。增加流速会恶化传质，线性流速应流速。增加流速会恶化传质，线性流速应为为0.1mm/s pH值的影响。值的影响。 离子强度的影响。离子强度的影响。222324 阴离子交换剂用英文字头阴离子交换剂用英文字头A A，阳离子交换剂，阳离子交换剂的英文字头是的英文字头是C C。英文字后面的数字表示。英文字后面的数字表示Sephadex(Sephadex(葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶) )型号。型号。 G后面的阿拉伯数字是凝胶的吸水率(mLg干胶)乘以10。 吸水量越大，孔径越大，可分离的蛋白质分子量越大。25磺丙基磺丙基 阳离子交换剂阳离子交换剂26要考察的因素

15、或者说准备进行优化的项目：要考察的因素或者说准备进行优化的项目：交换容量；交换容量；缓冲溶液缓冲溶液pH值；值；缓冲液的离子强度；缓冲液的离子强度；27交换容量 交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。 影响交换容量的因素 ：一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。另一些影响因素如离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。 p4228293031缓冲液的pH值 蛋白质在离子交换色谱中分离的基础是用蛋白质在离子交换色谱中分离的基础是用pH值来控制蛋白质的电荷。如果流动相的值来控制蛋白质的电荷。如

16、果流动相的pH值高于蛋白质的等电点（值高于蛋白质的等电点（pI)，它将带有，它将带有净的负电荷；若流动相净的负电荷；若流动相pH值低于蛋白质值低于蛋白质pI，则显示净的正电荷。则显示净的正电荷。pI高的蛋白质最好在高的蛋白质最好在阳离子交换柱上分离，阳离子交换柱上分离，pI低的蛋白质可选低的蛋白质可选择阴离子交换柱。择阴离子交换柱。323334353637缓冲液的离子强度 在流动相中，盐的类型和在流动相中，盐的类型和pH值一样重要，值一样重要，这两个因素共同控制着蛋白质在离子交换这两个因素共同控制着蛋白质在离子交换色谱柱上的保留行为、分离度和回收率。色谱柱上的保留行为、分离度和回收率。 蛋白质

17、的带电特征和离子化决定了蛋白质蛋白质的带电特征和离子化决定了蛋白质在离子交换柱上参数的变化。在离子交换柱上参数的变化。 聚糖凝胶阳离子交换树脂葡聚糖凝胶阳离子交换树脂42最终确定的条件 凝胶柱规格： 2620 cm；洗脱条件：1 M醋酸 盐离子线性梯度为01 M NaC1；流速：68 mLh；检测波长：220 nm； 样量：400 mg分别收集6个不同组分并测定它们的降血压活性43 （3）亲和色谱法 固定相：载体配体 配体具有两个基本条件：与被纯化的物质有强的结合力；有与基质（载体）共价结合的基团 分辨率高、收率亦高 洗脱：用配体的竞争物或提高盐浓度、升高温度等44

18、（4）疏水色谱 水溶液中的蛋白质分子表面氨基酸残基的非极性侧链密集一起形成的疏水区。 依据疏水吸附剂与蛋白质疏水区间相互作用的强弱，可达到分离蛋白质的目的。45电泳法 不但可用于蛋白质的纯化，还常用于蛋白质纯度鉴定及理化性质测定。 最常用的分离纯化方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等。46离心法 是分离细胞器及各种大分子基本手段。是分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速转速1025kr/min的离心机称为高速离心机。的离心机称为高速离心机。 转速转速25kr/min，离心力，离心力89Kg者称为超速离心者称为超速离心机。机。 超速离心机的最高转速可达超速离心机的最高转速可达100000r/mi

19、n，离心，离心力超过力超过500kg。 47左上：普通台式离心机。左上：普通台式离心机。 左下：冷冻台式离心左下：冷冻台式离心机。右：超速离心机。机。右：超速离心机。48 普通和高速离心机主要用于分离制备生物普通和高速离心机主要用于分离制备生物大分子物质和亚细胞成分；大分子物质和亚细胞成分； 超速离心机则兼有制备性离心和超速离心机则兼有制备性离心和分析离心分析离心两种功能，由于转速高会产生大量的热量，两种功能，由于转速高会产生大量的热量，因而这种离心机都附有冷冻装置，以降低因而这种离心机都附有冷冻装置，以降低转子室内温度。转子室内温度。 49根据分离的对象和目的不同，超离心技术根据分离的对象和

20、目的不同，超离心技术可分为两大类：可分为两大类：用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品分析和测定制剂中大分子的种类和性质分析和测定制剂中大分子的种类和性质(浮力密度和分子浮力密度和分子量等量等)(preparative cetrifugation)(preparative cetrifugation)(analytical centrifugation)(analytical centrifugation)50S为沉降系数为沉降系数(秒秒)；R为沉降颗粒到转头中心的距离为沉降颗粒到转头中心的距离(半径，半径，cm)；为角速度，以每秒转动

21、的弧度为角速度，以每秒转动的弧度表示；表示；t为时间为时间(秒秒)。xdR/dtS251xdR/dtS2沉降系数沉降系数描述分析大小描述分析大小更多用于生物大分子的分类更多用于生物大分子的分类单位离心场中颗粒的沉降速度单位离心场中颗粒的沉降速度52离心分离方法 差速离心 密度梯度离心 等密度离心53（一）差速离心（一）差速离心 Differential centrifugation 特点：特点： 多次离心多次离心 分批分离分批分离 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。54Low speedHigh speedDifferential centrifuga

22、tion55（二）密度梯度离心（二）密度梯度离心 装载密度梯度介质装载密度梯度介质 梯度介质有足够大的溶解度梯度介质有足够大的溶解度 常用介质：蔗糖密度梯度系统常用介质：蔗糖密度梯度系统 制备：梯度混合器，层层铺垫制备：梯度混合器，层层铺垫 介质的最大密度比沉降样品的最小密度小。介质的最大密度比沉降样品的最小密度小。 适用于大小有别而密度相似的样品。适用于大小有别而密度相似的样品。56（三）等密度离心（三）等密度离心 常用介质：铯盐常用介质：铯盐 制备：铯盐在离心场中沉降形成密度梯度制备：铯盐在离心场中沉降形成密度梯度 特点：样品和介质同时在各自密度点位置上形成特点：样品和介质同时在各自密度点

23、位置上形成区带区带 介质的最大密度高于沉降组分的最大密度。介质的最大密度高于沉降组分的最大密度。 用于分离大小相近而密度不同的样品。用于分离大小相近而密度不同的样品。57膜分离法 （1）超滤 依据分子的大小和形状进行选择性过滤，有外加压力。 （2）透析58透析透析透析的主要用途是从生物大分子样品中除去盐透析的主要用途是从生物大分子样品中除去盐类或其它小分子物质。类或其它小分子物质。 透析法也可以用来除去与生物大分子结合较弱透析法也可以用来除去与生物大分子结合较弱的小分子或离子，如金属离子及酶的辅助因子的小分子或离子，如金属离子及酶的辅助因子NAD，FAD等。等。59 透析法分离效果的关键是根据

24、欲分离成分的透析法分离效果的关键是根据欲分离成分的具体情况选用规格适宜的透析膜。透析膜有具体情况选用规格适宜的透析膜。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白胶膜、玻璃纸膜膜）、蛋白胶膜、玻璃纸膜等。等。 透析法分离量较小，时间长，一般在实验室透析法分离量较小，时间长，一般在实验室中应用较多。中应用较多。60由于被透析的生物分子较高温度下易变性，所以透析一般在34下进行。6162 水， 一定pH和离子强度的缓冲液 高分子惰性物质的浓溶液透析液透析液63双水相系统萃取法 利用溶质在液液两相系统分配系数的差异，经分批萃取或连续萃取，可将溶质分离。

25、一定百分组成的两种水溶性高聚物的水溶液混合，或一种水溶性高聚物的水溶液和一种盐的水溶液混合，可形成双水相系统。 水溶性高聚物：PEG、葡聚糖等。 常用盐：磷酸钾、硫酸铵等。64微过滤 微过滤(Microfiltration)是透析技术的进一步发展，它以多孔薄膜为过滤介质，让样品溶液通过多孔膜(超滤膜)过滤。它可以用于滤除小颗粒，使混浊液澄清，也可以收集纯的沉淀供进一步分析。 深层滤器 滤膜滤器65冰冻干燥冰冻干燥 冷冻干燥过程一般在10400，真空度为1340 Pa的系统中进行。在低温低压条件下，水很容易升华为气体，几乎所有的液态物质都可挥发掉，而生物大分子及无机盐类则形成疏松的固体。由此得到

26、的固体样品可以长期保存，有些甚至可以保存多年而不失活性。 66左图左图 真空冷凝干燥仪真空冷凝干燥仪右图右图 超低温冰箱超低温冰箱67 定量前，经过一定的分离净化，纯化蛋白过程定量前，经过一定的分离净化，纯化蛋白过程 1光谱法光谱法 （1）紫外吸收光谱法）紫外吸收光谱法 原理：原理：AAs中含芳环：中含芳环： CH2 苯丙氨酸苯丙氨酸 Phenylalanine (Phe) CH2 色氨酸色氨酸 Tryptophan(Typ,Trp) -CH2- -OH 酪氨酸酪氨酸 Tyrosine (Tyr)NH（四）蛋白质的含量测定p28768 苯丙氨酸，苯丙氨酸， max257nmmax257nm 酪

27、氨酸，酪氨酸， max280nmmax280nm 色氨酸，色氨酸， max280nm max280nm 有苯环分子结构有苯环分子结构 280nm280nm附近有吸收附近有吸收 末端吸收末端吸收220nm220nm肽键，但有很多物肽键，但有很多物质在此有吸收质在此有吸收 蛋白质通常在蛋白质通常在280nm有最大吸收峰，核酸有最大吸收峰，核酸有干扰有干扰260nm 69 这一方法可用来这一方法可用来快速检测蛋白质成分快速检测蛋白质成分。通常用于。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰。它快速，对柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰。它快速，对蛋白质无破坏性。但蛋白质无破坏性。但不能严格的定量不能严格的定

28、量。不同的蛋。不同的蛋白质具有不同的消光系数，如果一种蛋白质中没白质具有不同的消光系数，如果一种蛋白质中没有苯丙氨酸有苯丙氨酸PhePhe，色氨酸，色氨酸TyrTyr或酪氨酸或酪氨酸TrpTrp残基，残基，用此方法就不能检出。用此方法就不能检出。 核酸可引起强干扰核酸可引起强干扰作用。当有核酸存在时，可进作用。当有核酸存在时，可进行行如下修正如下修正: : 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mgmgmLmL）1.51.5 A A280280一一0 07575 A A26026070 特点：特点： 粗测定量，不同蛋白粗测定量，不同蛋白phe tyr trp phe tyr trp 含量不同，含量不同， 有

29、标准品较准，有标准品较准， 抗干扰能力弱抗干扰能力弱 对蛋白无破坏，对蛋白无破坏， 常用于柱色谱中洗脱峰的测定常用于柱色谱中洗脱峰的测定71 （2 2）荧光光谱法）荧光光谱法 苯丙氨酸，苯丙氨酸， ex257nm ex257nm em280nm em280nm 强度强度弱弱 酪氨酸，酪氨酸， ex280nm ex280nm em303nm em303nm 强度强度强强 色氨酸，色氨酸， ex280nm ex280nm em348nm em348nm 强度强度强强 蛋白质蛋白质 ex280nm em340-350nm 722化学法化学法 （1）凯氏定氮法（）凯氏定氮法（kjeldehl meth

30、od）测测有机物含氮量经典方法有机物含氮量经典方法 （2）双缩脲法（）双缩脲法（Biuret method） （3）福林酚法（）福林酚法（Lowry method） （4）染料结合方法染料结合方法 当然蛋白质的测定方法很多，如总氮量法，福林当然蛋白质的测定方法很多，如总氮量法，福林酚试剂法，酚试剂法，双缩脲法，紫外吸收法等。近来已有专用的蛋白质分析仪，双缩脲法，紫外吸收法等。近来已有专用的蛋白质分析仪，但经典的凯氏定氮法仍是食品，饲料分析，种子鉴定及营养但经典的凯氏定氮法仍是食品，饲料分析，种子鉴定及营养和生化研究中最广泛应用且具有足够精度的方法。和生化研究中最广泛应用且具有足够精度的方法。7

31、31.凯氏定氮法（凯氏定氮法（p214） 原理：蛋白质中含氮量原理：蛋白质中含氮量14-1614-16 方法：方法： 消化消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） 蒸馏蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收吸收用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使HH+ + ） 滴定滴定用已标定的无机酸滴用已标定的无机酸滴（使（使H+ 恢复），恢复），计算总氮量计算总氮量 74 定义：定义：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将

32、铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 75原理蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4 凯氏定氮法凯氏定氮法反应式为： 2NH2+H2SO4+2H(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂） 2.在凯氏定氮器中

33、与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中 反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O 3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量 反应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3 76 所有试剂试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 2.1 硫酸铜。 2.2 硫酸钾。 2.3 硫酸。 2.4 2%硼酸溶液。 2.

34、5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 2.6 40%氢氧化钠溶液。 2.7 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。 77 定氮蒸馏装置：如图所示。 凯氏定氮法仪器凯氏定氮法仪器 1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶 78操作方法1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干

35、燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。 2、 按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加

36、热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 3、 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。 同时吸取10

37、.0ml试剂空白消化液按3操作。 79计算 X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100% X：样品中蛋白质的百分含量，g； V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml； N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度； 0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； m：样品的质量（体积），g（ml）； F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为1517.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71

38、，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。 80注意事项 （1） 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。 （2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。 （3） 硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。 （4） 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。 （5） 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用

39、。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。 （6） 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。 81 （ 7） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。 （8） 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。 （9） 吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。 （10） 以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格

40、，亦可免去用移液管，操作比较简便。 （11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物Cu(NH3)42+ （12） 这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。 82n评价：评价：优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。是公认的参考方法。缺点：操作复杂，费时，不适合常规检缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其测，血清各蛋白

41、含氮量会有所变化尤其是疾病时。是疾病时。n应用：标准蛋白的标定及校正其它应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法常规方法83 事件事件 安徽安徽阜阳等全国各地发生了劣质奶粉事件，不法商家为阜阳等全国各地发生了劣质奶粉事件，不法商家为了谋利，随意降低奶粉中蛋白质含量。了谋利，随意降低奶粉中蛋白质含量。 长长期饮用蛋白质含量极低的奶粉，首先会导致婴儿严重期饮用蛋白质含量极低的奶粉，首先会导致婴儿严重营养不良，随后会引起各种并发症，在外来细菌的侵袭营养不良，随后会引起各种并发症，在外来细菌的侵袭之下，婴儿几乎完全丧失了自身的免疫能力，病情发展之下，婴儿几乎完全丧失了自身的免疫能力，病情发展十分迅速，最

42、后婴头部严重水肿，几乎看不清五官，全十分迅速，最后婴头部严重水肿，几乎看不清五官，全身皮肤也出现了大面积的高度溃烂，伤口长时间无法愈身皮肤也出现了大面积的高度溃烂，伤口长时间无法愈合，最后导致呼吸衰竭而死亡。合，最后导致呼吸衰竭而死亡。84实验仪器:85实验步骤一、一、 消化液的制取消化液的制取 准确称取奶粉样品准确称取奶粉样品0.5g，置于凯氏烧瓶内，加入，置于凯氏烧瓶内，加入89gK2SO4,0.4gCuSO4.5H2O及及15ml浓浓H2SO4，加数粒玻璃珠，加数粒玻璃珠，缓慢加热，并小心地尽量减少泡沫产生，防止溶液外溅，使缓慢加热，并小心地尽量减少泡沫产生，防止溶液外溅，使样品全部浸于

43、样品全部浸于H2SO4内。样品中泡沫消失后，即加大火力至内。样品中泡沫消失后，即加大火力至溶液澄清，再继续加热约溶液澄清，再继续加热约1h，冷却至室温。沿瓶壁加入，冷却至室温。沿瓶壁加入50ml纯水，溶解盐类，冷却，转入纯水，溶解盐类，冷却，转入100ml容量瓶中，以纯水容量瓶中，以纯水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。二、二、NH3的固定的固定 1 1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中加数加数滴甲基红指示剂、几滴滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石及数粒沸石 86在整个

44、蒸馏过程中需保持此液为橙红色，否则补加H2SO4。接收液为20ml 2%的H3BO4溶液，其中加2滴混合指示剂，接收时使装置的冷凝管下口浸入吸收液的液面之下。 2、移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用少量水冲洗进样口，然后加入10ml 50% NaOH溶液于反应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开始回流记时，蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏，用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸收液内。 三、NH3的标定 用0.05mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。 四、蛋白质含量的计算87蛋白质（%）=总氮量（%）*K式中K为换算因数。各种食品的蛋白质换算因数稍有差

45、别，乳类为6.38，大米为5.95，花生为5.46等。 本实验为测定奶粉中的蛋白质含量，换算因数为6.3888三聚氰胺，俗称蜜胺、蛋白精 中常常需要测定食品的蛋白质含量，由于直接测量蛋白质技术上比较复杂，所以常用一种叫做凯氏定氮法的方法，通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含量。由于三聚氰胺与蛋白质相比含有更多的氮原子，所以在一些事件中被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象。89三聚氰胺HPLC-UV检测方法 三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方

46、法和中国农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果 (a)色谱柱：VenusilASBC84.6250mm；标准：FDA方法；流动相：缓冲液：乙腈=85：15；缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0；流速：1.0mL/min；柱温：40oC；波长：240nm (b)色谱柱：VenusilASB-C184.6250mm；标准：中国农业部颁标准方法；缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠；流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min;柱温：40；波长：240nm 空白加水平（mg/L）回收率0.0111

47、6%0.1108%0.592%296% 90加热加热NH322H180022222 双缩脲生成双缩脲生成在强碱性溶液中，双缩在强碱性溶液中，双缩脲与脲与CuSO4形成紫色形成紫色络合物，称为双缩脲络合物，称为双缩脲反应。反应。凡具有两个酰胺基或两凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反化合物都有双缩脲反应。应。 2.双缩脲法（双缩脲法（p287）91蛋白质中的肽键蛋白质中的肽键（-CONH-CONH-）在在碱性碱性溶液中能与溶液中能与Cu2+作用而产生作用而产生紫红紫红色络合物色络合物，其

48、颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。子量及氨基酸成分无关。N 端端C 端端条件：至少含两个肽键（条件：至少含两个肽键（-CONH-CONH-）基）基团才能和团才能和CuCu2+2+形成络合物形成络合物, ,氨基酸及二氨基酸及二肽无反应肽无反应, ,三肽以上才能反应。三肽以上才能反应。92n评价：评价：优点：简便，准确，重复性好，优点：简便，准确，重复性好，10g-10g-120g/L120g/L线性好，特异性与精密度好，批内线性好，特异性与精密度好，批内CV%CV%2%2%，显色稳定。，显色稳定。缺点：灵敏度较差

49、，对蛋白质含量低的体缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。液标本不适合。n应用：应用：常规推荐方法。手工或上机使用。常规推荐方法。手工或上机使用。93Folin-Folin-酚试剂法酚试剂法（p287p287） 原理：原理： 蛋白质分子中的蛋白质分子中的酪氨酸残基酪氨酸残基和和色氨酸色氨酸残基残基能够和检测能够和检测酚基酚基的的FolinFolin试剂（试剂（磷钨酸磷钨酸盐盐- -磷钼酸盐）磷钼酸盐）反应生成蓝色化合物，反应生成蓝色化合物，在酚试剂中加入在酚试剂中加入CuCu2+2+（75%75%呈色），提高了呈呈色），提高了呈色的灵敏度，为色的灵敏度，为双缩脲法的双缩脲法的100

50、100倍左右。倍左右。94n评价及应用：评价及应用：优点：操作简单，改良法灵敏度高优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-6010g-60g），适合测定蛋白含量，适合测定蛋白含量少的标本。少的标本。缺点：各种蛋白质缺点：各种蛋白质酪氨酸酪氨酸和和色氨酸色氨酸比例比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。药物干扰。955.5.染料结合法染料结合法甲基橙甲基橙(Methyl Orange)法法考马氏亮蓝考马氏亮蓝（CBB ）法）法96 甲基橙(Methyl Orange)法 在在pH 35的缓冲溶液中，白蛋白与甲基的缓冲溶液中，白蛋白与甲基橙橙(Mo)的亲和

51、性比其它蛋白质的亲和性强，的亲和性比其它蛋白质的亲和性强，染料和蛋白质结合所形成的络合物在染料和蛋白质结合所形成的络合物在550 nm处的光吸收减小。处的光吸收减小。 该方法不适合于作为蛋白质定量的一般方该方法不适合于作为蛋白质定量的一般方法，因为即使都是白蛋白，由于其来源的法，因为即使都是白蛋白，由于其来源的不同，蛋白质与该染料的亲和性差异较大不同，蛋白质与该染料的亲和性差异较大。97考马氏亮蓝考马氏亮蓝（CBB ）法）法 在酸性条件下在酸性条件下(146 mol1 H3P04介质介质)，CBB的颜色为浅红色，的颜色为浅红色，最大吸收波长在最大吸收波长在464和和595 nm，但与蛋白质反应之后生成深蓝色的复合物，在但与蛋白质反应之后生成深蓝色的复合物，在595 nm处的光吸收强度大大加强处的光吸收强度大大加强 。 该反应只需该反应只需25 min，颜色至少可稳定一个小时。，颜色至少可稳定一个小时。其灵敏度为其灵敏度为120gml，比劳里法的灵敏度约，比劳里法的灵敏度约高高4倍，是目前最灵敏的染料结合分析法之一。倍，是目前最灵敏的染料结合分析法之一。 98溴甲酚绿溴甲酚绿(Bromocresol Green) 甲酚紫甲酚紫(Bromocresol Purp