分子生物学基本技术

1、整理ppt分子生物学基本技术分子生物学基本技术整理ppt 讲授内容n一、分子杂交与印记技术一、分子杂交与印记技术n二、二、PCR技术技术n三、基因文库三、基因文库n四、四、DNA测序技术测序技术n五、芯片技术五、芯片技术n六、蛋白质相互作用研究六、蛋白质相互作用研究整理ppt一、分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology整理ppt核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液

2、中，或把DNA与与RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定的的碱基配对碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形关系，就可以在不同的分子之间形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex) 。一、基本原理一、基本原理整理ppt（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术 探针探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。断

3、是否有同源的核酸分子存在。 整理ppt二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体、重组质粒和噬菌体的分析。的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 整理ppt三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显

4、显影影照照片片整理ppt 其他杂交技术：其他杂交技术：斑点印迹斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)整理ppt斑点杂交（斑点杂交（dot blotting） 将将RNA或或DNA变性后直接点样于硝酸纤变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。及其表达产物的定性及定量的研究。整理ppt 反向斑点杂交反向斑点杂交（reverse dot blotting） 先将探

5、针固定于硝酸纤维素膜或尼龙先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品膜上，将样品RNA或或DNA标记变性后进行标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率诊断的效率。整理ppt13 原位分子杂交技术原位分子杂交技术 n原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；n可用于基因及其表达产物的定位分析。可用于基因及其表达产物的定

6、位分析。整理ppt荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）整理pptDNA点阵点阵整理ppt 二、聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本原理一、基本原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。整理pptn模板模板DN

7、An 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ 二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分整理ppt三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C整理ppt（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途整理ppt三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技

8、术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCRPCR技术原理技术原理整理ppt三、基 因 文 库 Gene Library整理ppt基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library)cDNA文库文库 (cDNA library) 基因文库基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。整理ppt基因组基因组DNA文库文库整理ppt第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例整理ppt 四四、DNA序列测定分析 Nucleic Acid Sequen

9、ce Analysis整理ppt一、一、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法整理ppt整理ppt二、二、DNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集分子使之发射出四种不同波长

10、荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 整理pptDNA自动测序结果举例整理ppt 五、芯片分析技术 Biological Chip Technology整理pptDNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)整理ppt整理ppt是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反阵固定在固相支持物上