PCR扩增产物的分析实用教案

1、PCRPCR扩增产物扩增产物(chnw)(chnw)的电泳分析的电泳分析琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测常用于临床检测(jin c)（定性）（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测可用于科研及检测(jin c)分析分析第1页/共59页第一页，共60页。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻(hi zo)中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液

2、体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等第2页/共59页第二页，共60页。凝胶浓度凝胶浓度(nngd)(nngd)选择选择琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)线型线型DNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离(fnl)范围第3页/共59页第三页，共60页。电泳电泳(din yn)缓冲液缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片

3、段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜(biny)，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解第4页/共59页第四页，共60页。1010TBETBE缓冲液的配制缓冲液的配制(pizh)(pizh)配方(pi fng)Tris 108克克硼酸 55克H2O至 1000mlpH应为临用时用水稀至TBE（20倍稀释）第5页/共59页第五页，共60页。核酸核酸(h sun)电泳的指示剂电泳的指示剂 指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体(yt)中呈紫兰色 电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片

4、段琼脂糖凝琼脂糖凝胶浓度胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb第6页/共59页第六页，共60页。核酸核酸(h sun)电泳的指示剂电泳的指示剂 二甲苯青：水溶液呈兰色， 电泳时，其迁移(qiny)速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2Kb1.6Kb第7页/共59页第七页，共60页。载样缓冲液载样缓冲液指示剂一般与蔗糖(zhtng)、甘油或聚蔗糖(zhtng)400组成载样缓冲液作用：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色，使加

5、样操作更方便第8页/共59页第八页，共60页。核酸核酸(h sun)电泳的染色剂电泳的染色剂最常用(chn yn)的染色剂溴化乙锭银染色第9页/共59页第九页，共60页。核酸核酸(h sun)电泳的染色剂电泳的染色剂 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子(fnz)可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸

6、泡30min后再观察第10页/共59页第十页，共60页。核酸核酸(h sun)电泳的染色剂电泳的染色剂 银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒(kl)，可把核酸电泳带染色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收第11页/共59页第十一页，共60页。电泳电泳(din yn)电泳装置电泳仪电泳槽灌胶模具(mj)等第12页/共59页第十二页，共60页。电泳仪 普通(ptng)电泳仪 高压电泳仪第13页/共59页第十三页，共60页。电泳槽 水平平板(pngbn) 垂直平

7、板(pngbn)第14页/共59页第十四页，共60页。电泳电泳(din yn)方法方法 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净(gnjng)，放在水平桌面上，并架好梳子 根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般 200400 bp 的DNA片段（可配制1.7%）第15页/共59页第十五页，共60页。电泳方法电泳方法(fngf)配制琼脂糖凝胶及倒胶配制琼脂糖凝胶及倒胶 TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60(需要时可加入(jir)EB)，倒入电泳槽中，待凝固 向电泳槽中倒入0.5 TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如

8、样品孔内有气泡，应除去）第16页/共59页第十六页，共60页。电泳方法电泳方法(fngf)上样与通电上样与通电 在DNA样品中加入体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内 接通电源，一般红色为正极(zhngj)黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极(zhngj)泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1 5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳，一般 200400bp 的PCR产物50V电压，电泳2040min第17页/共59页第十七页，共60页。电泳电泳(din yn)方法方法结果观察结果观察 紫外仪上观察(gunch)电泳带及其位置 并与核酸分子量标准比

9、较被扩增产物的大小第18页/共59页第十八页，共60页。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析(fnx) 其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离第19页/共59页第十九页，共60页。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小(dxio)是由丙烯酰胺的浓度决定的第

10、20页/共59页第二十页，共60页。不同不同(b tn)(b tn)浓度丙烯酰胺和浓度丙烯酰胺和DNADNA有效有效分离范围分离范围 丙烯酰胺丙烯酰胺（%）有效分离范围有效分离范围（bp）溴酚兰溴酚兰*二甲苯青二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245第21页/共59页第二十一页，共60页。材料材料(cilio) 电泳(din yn)仪器： 电泳(din yn)仪 垂直电泳(din yn)槽及其附件. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1克

11、 H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4可保存二个月第22页/共59页第二十二页，共60页。材料材料(cilio) 10%过硫酸铵 过硫酰铵，1克，加水至 10 ml4可保存(bocn)一周，-20可保存(bocn)一个月 1TBE电泳缓冲液 TEMED（四甲基乙烯基二胺）第23页/共59页第二十三页，共60页。聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备(zhbi)与电泳与电泳 配胶：根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出 将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角 按表3配制所需%浓

12、度凝胶的毫升数 加入TEMED后，立即(lj)混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止第24页/共59页第二十四页，共60页。聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备(zhbi)与电泳与电泳 立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10角，可减少(jinsho)液体泄漏的机会 室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入TBE缓冲液第25页/共59页第二十五页，共60页。聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备(zhbi)与电泳与电泳 小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸

13、附的及凝胶顶部未聚合(jh)的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合(jh)，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则 将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡第26页/共59页第二十六页，共60页。聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备(zhbi)与电泳与电泳 接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳 电泳毕，切断(qi dun)电源，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上，浸入含ug/ml的溴化乙锭溶液中，1530min后取出水洗，紫外仪下观察结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带（要求更高的灵敏度，可用银染）第27页/共

14、59页第二十七页，共60页。第28页/共59页第二十八页，共60页。第29页/共59页第二十九页，共60页。电泳电泳(din yn)结果分析结果分析 DNA Marker DNA 人工(rngng)片段 100 bp ladder第30页/共59页第三十页，共60页。酶切分析酶切分析(fnx) 根据(gnj)PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切 酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究第31页/共59页第三十一页，共60页。分子分子(fnz)杂交杂交检测PCR产物特异性的有力证据检测PCR 产物碱基突变(tbin)的有效

15、方法主要的杂交 Southern印迹杂交斑点杂交第32页/共59页第三十二页，共60页。SouthernSouthern印迹杂交：印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记（探针）与 PCR 产物杂交此法既可作(k zu)特异性鉴定，又可以提高检测 PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。第33页/共59页第三十三页，共60页。第34页/共59页第三十四页，共60页。斑点杂交：斑点杂交：将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上寡核苷酸探针杂交观察有无着色斑点主要用于 PCR产物特异性鉴定及变异(biny)分析第35页/共59页第三十五页，共60页。RDB检测 -

16、地中海贫血(pnxu)突变基因-29（AG）-28（ AG）17（ AT，AAG TAG）E （CD26 GAG AAG）IVS-I-1（ GT ）IVS-I-5（ GC）27-28（+C）41-42（-CTTT）43（ GT ）71-72（+A或+T）654（ CT）第36页/共59页第三十六页，共60页。微孔板夹心微孔板夹心(jixn)杂交法杂交法 通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异性杂交，使PCR产物间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交，漂洗后显色(xin s)即可判断结果 该法使用了两个杂交过程来检测一个产

17、物，其特异性较一次杂交的检测法高第37页/共59页第三十七页，共60页。：NOS（11014/cm2） N-羟化琥珀(h p)酰亚胺酯第38页/共59页第三十八页，共60页。 -CCCCCCCapture Probe:：NH2Detection Probe:：Biotin第39页/共59页第三十九页，共60页。第40页/共59页第四十页，共60页。：NH2标记(bioj)的探针：Biotin标记(bioj)的探针Avidin-HRP 显色(xin s)系统：NOS基团第41页/共59页第四十一页，共60页。微孔板夹心微孔板夹心(jixn)杂交法杂交法 方法学评价方法学评价 敏感度：该法检测HB

18、V，敏感度达5个HBV DNA分子(fnz) 敏感性和特异性与 PCR 32P 探针的Southern杂交法相当 PCR微孔板夹心杂交法：操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA第42页/共59页第四十二页，共60页。微孔微孔(wi kn)板直接杂交板直接杂交 不是采用夹心法，而是直接将特异的探针固定于微孔(wi kn)板上，然后用生物素标记的PCR产物与之杂交 只进行一次杂交，方法简单，但特异性不高第43页/共59页第四十三页，共60页。微孔板杂交的基本微孔板杂交的基本(jbn)过程过程 DNA的固定 探针(tn zhn)的杂交 酶联显色第44页/共

19、59页第四十四页，共60页。DNADNA的固定的固定(gdng)(gdng) 在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上 不同来源的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度（mol/L NaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固定浓度的标记探针杂交(zjio)。显色后，判断合适的固定盐浓度第45页/共59页第四十五页，共60页。DNADNA的固定的固定(gdng)(gdng) 固定方法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响(yngxing)杂交 用合适浓度的 NaCl 或（NH4）2SO4 可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。 盐浓度合适时，DNA应为一端固定到

20、微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使DNA “平躺”固定在孔内而影响(yngxing)杂交第46页/共59页第四十六页，共60页。DNADNA的固定的固定(gdng)(gdng)Mg2+虽有促进DNA固定的作用(zuyng)，但它可激活Dnase，所以，一般不用被固定的DNA应大于300bp，否则影响杂交结果。每孔可固定高达 200ng（624bp）的DNA盐浓度和固定量确定后，按下法固定DNA第47页/共59页第四十七页，共60页。DNADNA的固定的固定(gdng)(gdng) 待固定DNA 100加热 5min 变性，并立即冷却，与合适的固定液混合后，加入(jir)微孔板的孔内 固定液：

21、10mmol/L磷酸钠-10mmol/L EDTA，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后，终浓度为最适固定浓度） 用胶布封好，浸于37水浴2h 用PBS-0.05%Tween20 漂洗3次立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存第48页/共59页第四十八页，共60页。杂交杂交(zjio)与显色与显色 杂交 可采用标准的杂交系统杂交 夹心杂交时，是将变性(binxng)的PCR产物与检测探针一并加入 杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短 显色 根据不同酶标，检测分子的不同来选择不同的底物、终止剂和测定波长第49页/共59页第四十九页，共60页。 颜色(yns)互补分析法（A） 利用三原色原理，当不同DNA

22、片段（A和B）同时扩增时，用引物5端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧光素，B标记红色的罗丹明） 如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有一种颜色（红色或绿色） 如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过(tnggu)电泳分离，紫外激发后可观察到不同颜色的两条带 如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一条红绿互补色-黄色带 如果不用电泳法分离扩增片段，通过(tnggu)一定手段除未掺入引物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见一条红绿互补的黄色条带第50页/共59页第五十页，共60页。颜色互补颜色互补(h b)分析法分析法 方法学评

23、价方法学评价该法简便、易于自动化可用于检测基因（缺失、染色体转位）和病原微生物只判断产物的有无在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型时，可用复合(fh)PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM等）第51页/共59页第五十一页，共60页。PCR-ELISAPCR-ELISA法：法：本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规(chnggu)ELISA记数仪检测5端修饰后仍可进行常规(chnggu)PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5端使其携带便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5端的修饰使产物便于检测操作过程第52页/共59页第五十二页，共60页。1 链亲和素包被链亲和素包被(bo bi)： 聚丙乙烯微孔板，包被(bo bi)效果差异并不显著 亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司） 用PBS-Tween液140mmol/L NaCl， KCl，2HPO4，2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，配成1g/ml 向微孔板的