二维电泳的蛋白质提取与样品制备PPT学习教案

1、会计学1二维电泳的蛋白质提取与样品制备二维电泳的蛋白质提取与样品制备第1页/共51页第2页/共51页第3页/共51页第4页/共51页n在等渗溶液中处理细胞在等渗溶液中处理细胞第5页/共51页n产生剪切力产生剪切力第6页/共51页n剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁第7页/共51页毒性低，毒性低，AEBSFAEBSF可能改变蛋白的等可能改变蛋白的等电点电点第8页/共51页（aprotininaprotinin）能抑制许多丝氨酸）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；蛋白酶；苯丁抑制剂苯丁抑制剂（bestatinbestatin）能抑制氨基多肽酶能抑制氨基多肽酶第9页/共51页第10页/共51

2、页第11页/共51页第12页/共51页第13页/共51页第14页/共51页第15页/共51页第16页/共51页第17页/共51页第18页/共51页样品中太多盐离子干扰样品中太多盐离子干扰IEF丙酮沉淀去除盐和杂质丙酮沉淀去除盐和杂质第19页/共51页A.蛋白提取物蛋白提取物未经处理未经处理B.经脱盐处理经脱盐处理C.商品化试剂商品化试剂盒沉淀处理盒沉淀处理第20页/共51页带电荷杂质带电荷杂质第21页/共51页样品不纯样品不纯第22页/共51页第23页/共51页第24页/共51页第25页/共51页第26页/共51页第27页/共51页第28页/共51页第29页/共51页第30页/共51页导致蛋白

3、酶失活，进而减少蛋白导致蛋白酶失活，进而减少蛋白质降解，去除杂质、富集碱性蛋质降解，去除杂质、富集碱性蛋白质白质七、样品制备七、样品制备第31页/共51页第32页/共51页第33页/共51页第34页/共51页的盐、脂类、多糖和核酸等物质的盐、脂类、多糖和核酸等物质n样品中蛋白质在样品中蛋白质在2-DE过程中必须过程中必须保持可溶性保持可溶性第35页/共51页第36页/共51页第37页/共51页第38页/共51页蛋白样品蛋白样品40mmol/L Tris收集上清收集上清冷冻干燥冷冻干燥8mol/L Uter,4%CHAPS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%CA在在

4、40mmol/L Tris中不溶的沉淀中不溶的沉淀8mol/L Uter,4%CHAPS,2mmol/L TBP,40mmol/L Tris,0.5%CA收集上清收集上清第39页/共51页在在8mol/L Uter,4%CHAPS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%CA中不溶的沉淀中不溶的沉淀5mol/L Uter,2mol/L thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/L TBP,40mmol/L tris-base,0.5%CA收集上清收集上清在在5mol/L Uter,2mol/L thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/L TBP,40mmol/L tris-base,0.5%CA不溶的沉淀不溶的沉淀分步提取法示意分步提取法示意图图第40页/共51页第41页/共51页第42页/共51页第43页/共51页第44页/共51页第45页/共51页结核分枝杆菌胞外蛋白和膜蛋白结核分枝杆菌胞外蛋白和膜蛋白2DE图谱图谱 第46页/共51页第4