westernblot详解PPT学习教案

1、会计学1westernblot详解详解 电泳槽 玻璃板、梳子、加样校准架等 电转移槽 切胶板、黑白夹板、海绵垫等 电泳仪 用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。 第1页/共53页Western blot 实验原理抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂第2页/共53页第3页/共53页第4页/共53页 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacyl

2、amide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。第5页/共53页 单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化学催化（核黄素TMTED）体系。第6页/共53页第7页/共53页一一 配配分离分

3、离胶胶准备物品：准备物品： 玻璃板玻璃板 洗衣粉洗衣粉 灌胶架灌胶架 移液枪移液枪 两个烧杯（两个烧杯（ 1 1 ml 200ul 20ulml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M 30%Acrylamide 1M （4 4度冰箱），度冰箱）， Tris-HCL Tris-HCL 溶液（溶液（PH=8.8PH=8.8）， ddH2O 10%APddH2O 10%AP （-20-20冰箱）冰箱） ， TEMDTEMD（4 4度）度） ，SDSSDS（常（常温）温）1 1 清洗玻璃板：清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻

4、擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2OddH2O冲洗干净后立在通冲洗干净后立在通风处或烘箱中风处或烘箱中2 2 配制分离胶：配制分离胶：玻璃板对齐后放入夹中玻璃板对齐后放入夹中加紧加紧，注意使两玻璃板，注意使两玻璃板对齐对齐。然后垂直。然后垂直卡在架子上准备灌胶。卡在架子上准备灌胶。先配制分离胶。配方如下：先配制分离胶。配方如下：第8页/共53页 具体情况依照说明书第9页/共53页 灌分离胶灌分离胶：用用1ml1ml的移液枪吸取的移液枪吸取1ml1ml胶沿玻璃放出，溶液缓胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为慢加入到装配好的玻璃板中至

5、凝胶高度为6cm6cm左左右，预留右，预留1.5cm1.5cm高度配制浓缩胶。高度配制浓缩胶。用用1ml1ml的移液枪吸取的移液枪吸取1ml1ml左右的左右的异丙醇，压平异丙醇，压平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形。形。温箱放置温箱放置0.5-1h0.5-1h左右至聚合完全。左右至聚合完全。注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶，胶， 灌灌胶速度须缓慢胶速度须缓慢，避免产生气泡，避免产生气泡 灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平第10页/共53页ddH2O0.1%SD

6、S:8%第11页/共53页第12页/共53页6%的浓缩胶的浓缩胶4mlddH2O2.39ml30%Acrylamide0.544ml1 M T r i s - H C L 溶 液溶 液（PH=6.8）1.02ml10%APS40.82ulTEMD2.04ul第13页/共53页冰箱过夜冰箱过夜待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草纸铺于保鲜膜上。用草纸铺于保鲜膜上。用ddH2OddH2O浸湿草纸。取玻璃板放浸湿草纸。取玻璃板放于草纸上，包好。放入于草纸上，包好。放入44冰箱过夜。冰箱过夜。第14页/共53页第15页/共53页第16页/共53页第

7、17页/共53页第18页/共53页 5X5X电泳液缓冲液电泳液缓冲液 TrisTris（MW121.14MW121.14） 15.1g 15.1g 甘氨酸（甘氨酸（MW75.07MW75.07） 94g 94g SDS SDS 5.00g 5.00g 蒸馏水至蒸馏水至 1000ml 1000ml 第19页/共53页第20页/共53页 蛋白样品第21页/共53页第22页/共53页第23页/共53页第24页/共53页第25页/共53页第26页/共53页4X上样缓冲液 1.0 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.04g 甘油 4ml去离子水定容至10ml。

8、混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。使用时稀释成1X。第27页/共53页第28页/共53页 主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的使用预染的MarkerMarker还可以实时检测电泳还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。分离情况，并可以转移到膜上。蛋白质蛋白质MarkerPrestained protein laddersUnstained protein laddersFermentas第29页/共53页第30页/共53页上样第31页/共53页Anode -内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触Cath

9、ode +带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳小分子量蛋白跑的比较快小分子量蛋白跑的比较快. . 蛋白根据分子量大小分开蛋白根据分子量大小分开蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动标本加入到上样孔中第32页/共53页第33页/共53页 10X10X转膜缓冲液转膜缓冲液 甘氨酸（甘氨酸（MW75.07MW75.07） 151.1g 151.1g TrisTris（MW121.14MW121.14） 30.3g 30.3g 蒸馏水至蒸馏水至 1000ml

10、1000ml 溶解后室温保存溶解后室温保存, ,用时稀释用时稀释1010倍，并倍，并加入甲醇加入甲醇至至20%20% 第34页/共53页第35页/共53页第36页/共53页第37页/共53页封闭液封闭液BSABSA（5%5%脱脂牛奶脱脂牛奶) )： 1XTBST1XTBST缓冲液缓冲液 95-100 ml95-100 ml 脱脂奶粉脱脂奶粉 /BSA/BSA 5g5g溶解后溶解后44保存，可于一周内使用保存，可于一周内使用。第38页/共53页一抗的孵育一抗的孵育准备物品：准备物品： 目的蛋白一抗目的蛋白一抗 内参蛋白（内参蛋白（GAPDHGAPDH，beta-actinbeta-actin或或

11、beta-tubulinbeta-tubulin）一抗）一抗 摇床摇床 放在摇床上放在摇床上洗膜洗膜。第39页/共53页准备物品：准备物品： 目的蛋白二抗目的蛋白二抗 内参蛋白（内参蛋白（GAPDHGAPDH，beta-actinbeta-actin或或beta-tubulinbeta-tubulin）二抗）二抗 容器容器 44冰箱冰箱 摇床摇床 从从-20-20冰箱中取出已经稀释好的二抗溶液冰箱中取出已经稀释好的二抗溶液，室温下融化。，室温下融化。第40页/共53页第41页/共53页第42页/共53页第43页/共53页第44页/共53页常见问题第45页/共53页第46页/共53页？ 第47页

12、/共53页转移到膜上的蛋白很少1.蛋白分子量 10KD2.蛋白的等电点 93.SDS浓度不合适4.凝胶太厚 原因对策1.蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜2.更换高pH值Buffer3.在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率4.延长转膜时间第48页/共53页1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高 原因对策1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度背景太高第49页/共53页杂交信号很弱1.抗体保存不