三七总皂苷及其诱导成骨的试验和机制

1、三七总皂苷及其诱导成骨的试验和机制在临床， 三七被广泛应用于创伤和骨折治疗中， 其主要成分 三七总皂苷是一种多系统靶向性药物， 可以调节多种成体干细胞 的分化。PNS对骨形成的促进作用主是通过刺激细胞信号转导通 路，激活或抑制相应的基因表达来实现的。PNS具有止血、活血、补血，改善脑血流功能， 保护脑神经， 增强免疫力， 抗炎，镇痛， 抗肝纤维化和改善肾脏功能的作用。 这些皆与成骨过程有莫大的 关联，可为临床治疗骨折不愈提供一种新的骨修复模式。1 三七总皂苷的提取传统的PNS提取主要为溶剂提取法，包括浸渍法、煎煮法、 渗漉法、回流提取法，但溶剂提取法操作时间长、过程复杂和合 成费用高。现代的P

2、NS提取，如微波、超声、酶提取法和超临界 流体萃取等， 针对传统提取方法的缺点进行了改进， 操作时间大 大缩短，提取效率增高。超声提取法以乙醇为提取溶剂，可在较 低的温度下提取，简化了操作过程，提高了 PNS的纯度。酶提取 法以水为提取溶剂，提取物的有效成分活性高，专一性强，环境 污染性较低；但是，水溶剂的酸碱度对PNS的质量和效率影响较 大，宋宏新等采用模拟人体消化道酸碱度分次提取的方法， 取得 了较好的效果。另有研究以超临界流体萃取技术提取 PNS以超临界流体代CO2替常规有机溶剂对中草药有效成分进行萃取和分离。其中，超临界流体萃取术萃取能力强、萃取效率高、生产周期短，易挥 发组分极少损失

3、或破坏生理活性物质， 易于发现中药中新的活性 成分，且无溶剂残留，产品质量高。PNS的极性较强，相对分子质量也较大，在萃取过程中将表面活性剂和水引入到CO2超临界流体中形成反相微乳体系，可以提高对PNS的萃取效率。此外，湿式超微粉碎提取法和双水相萃取法，都取得了较好的提取效 果；但要实现其工业化，目前的生产成本还较高。2 三七总皂苷诱导成骨试验2.1 体外试验骨髓基质干细胞（bonemarrow stromalcell ， BMSC发育为 成骨细胞后可合成和储存骨基质， 增加骨质量和调节破骨细胞的 生成及活性，因此可通过 BMSC勺活性来探讨PNS的成骨分化作 用。李学东等在BMSC中加入PN

4、S后发现，细胞增殖、碱性磷酸 酶（alkaline phosphatase, AKP活性、钙结节形成均增加，即PNS可明显促进BMSC勺成骨分化及增殖。吴丽萍等发现，在 BMSC中大剂量地加入PNS后，细胞AKP的分泌量反而下降，且 与对照组和小剂量组有较大差别。他们认为，小剂量的PNS可能对成骨细胞的生长促进作用更大。他们还发现，50mg?L-1质量浓度的PNS对成骨细胞的生长促进作用最明显。道盛华刚等发 现，在Z = （PNS淫羊藿苷）=5: 2配伍时，可明显促进成骨细 胞增殖且成骨细胞出现明显的钙化显现。Li等发现，PNS可明显地促进BMSC勺矿化，可上调其 AKP核心结合因子-a 1和

5、骨涎蛋白基因表达，下调过氧化物酶增生物激活受体Y 2基因表达。Jang等发现，PNS可以抑制脂多糖诱导的细胞外信号调节激酶 -1、2 激活，降低破骨细胞的活性，促进成骨，下调基质金属蛋 白酶-9 和诱导型一氧化氮合酶的表达，减轻炎症反应。2.2 体内试验将PNS用于骨缺损的动物模型显示， 在PNS乍用后的骨痂面 积、外骨痂厚度均明显增加， 表明PNS加快成骨进程是通过刺激 骨痂增生实现的，PNS可使矿化过程提前发生。Shen等通过给予 骨质疏松大鼠注射不同剂量的 PNS发现，PNS可改善骨质疏松大 鼠的骨量丢失状况， 明显增加大鼠腰椎及股骨的骨密度并改善其 骨微结构，即PNS有治疗和预防骨质疏

6、松的潜力。张磊等发现， PNS可促进大鼠腱-骨愈合，促进腱-骨界面胶原生长及新骨形成， 提高腱 - 骨愈合质量。3 三七总皂苷诱导成骨的机制3.1 细胞因子成骨过程按照特定顺序启动核心结合因子 -a 1、成骨细胞特 异性转录因子(Osterix , Osx)、AKP骨粘连蛋白、1型胶原 和骨钙蛋白等骨相关基因， 进而启动成骨分化的，而PNS可影响 上述特定因子的表达进而影响成骨过程。 此外，骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein , BMP为一种促进成骨细胞增殖 的细胞因子， 是骨组织形成过程中最关键的调节因子。 在人或动 物的体外模型中，BMP可刺激BMS(分化为

7、成骨细胞。刘东宁等认为，PNS可能是通过上调BMP-2的表达水平，进而促进成骨细 胞分化的。胰岛素样生长因子（ insulin-likegrowth factor ， IGF）-1 通过成骨细胞间接地促进破骨细胞的生成，增强其活性。IGF-1 是成骨细胞和破骨细胞的偶联因子，可同时促进骨形成和 骨吸收。成骨细胞分泌白细胞介素（ interleukin ， IL ）-6 等细胞因 子，使得骨组织微环境内 IL-6 的质量上升。 IL-6 具有破骨细胞 激活因子的性质，破骨细胞上的 IL-6 受体会增强骨吸收。 PNS 可促进成骨细胞增长，促进成骨细胞分泌 IGF-1 ，抑制成骨细胞 分泌 IL-

8、6 ，从而抑制破骨细胞增长，抑制骨吸收功能，起到诱 导成骨的作用。此外，骨保护蛋白（osteoprotegerin , OPG是 影响破骨细胞分化和成熟，调节骨代谢的关键因子。PNS可以提高OPG勺表达，这一方面可能缘于PNS通过抑制肿瘤坏死因子的 分泌而作用于成骨细胞，另一方面也可能系PNS直接作用于成骨 细胞而起作用。3.2 信号转导通路3.2.1 促丝裂原激活蛋白激酶 促丝裂原激活蛋白激酶是一 类分布于细胞质中具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白 激酶，可调控哺乳动物细胞的增殖和分化。MAPK主要通过ERKP38和c-Jun N-末端激酶三条信号转导通路调控骨代谢。MAPK激活后，通过

9、ERK P38和c-Jun N-末端激酶信号转导通路促进 破骨细胞分化，其中MAPI介导的激活蛋白-1为促进破骨细胞分 化的关键因子。Li等发现，PNS通过激活ERK和P38信号转导通 路促进骨形成，而 PD98059（ERK抑卩制剂）和SB203580 （ P38抑 制剂）可明显抑制PNS的促骨形成作用。Jang等发现，PNS抑制 脂多糖诱导的 ERK-1、2 激活，从而降低破骨细胞的活性，促进 成骨，PNS可下调基质金属蛋白酶-9和诱导型一氧化氮合酶的表 达，减轻炎症反应。3.2.2 无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族 无翅型小鼠 乳房肿瘤病毒整合位点家族信号转导通路在维持骨量， 调控骨重

10、 塑和骨分化方面均起到关键性的作用。核因子-k B受体活化因子配体与表达于破骨细胞及其前体细胞表面的NF-KB受体活化因子结合，为破骨细胞的分化和存活所必需，OPG则可抑制二者的结合，从而抑制破骨细胞的成熟并诱导破骨细胞程序性死亡。 有研究者发现，PNS上调B -连环蛋白和细胞周期蛋白 D1的表达 并激活WNTt号转导通路；在 WNT言号转导通路激活后，PNS上 调OPG勺表达，下调RANK啲表达，促进成骨细胞的分化；因此， PNS可能通过激活WNTW号转导通路，进而下调 RANKI和OPG言 号转导因子以促进骨形成。吴丽萍等也证实，PNS通过抑制RANKL 的表达，降低破骨细胞的生成与活性，

11、抑制骨吸收，从而发挥促 成骨作用。以上研究提示，PNS通过影响WNT言号转导通路来调 控骨形成。3.2.3NF- k B NF- k B是一类与多种基因启动子或增强子上 的B位点特异性结合并促进其基因转录的蛋白质总称，PNS可降低NF- k B的活性。PNS对OPG勺影响，也可能通过抑制 NF- k B 的活性干预NF-k B信号转导而起作用。确切的机制还需要更深 入的研究。4 结语羟磷灰石作为支架材料具有良好的成骨作用，其与PNS复合后可将PNS的成骨作用定向用于骨缺损部位。此外，脱乙酰壳多 糖（俗称壳聚糖）也可作为支架材料，因其具有很强的亲水性， 可膨胀形成胶体黏稠物质而阻滞药物扩散及溶出， 是当下常用的 天然可生物降解的缓释材料。有研究者选用乳化交联法制备的PNS脱乙酰壳多糖微球，在开始0.5h内的释放量小于40%质量分 数，有明显的缓释作用。 亦有人在以乳化交联技术制备出脱乙酰 壳多糖-PNS微囊后发现，