结核与耐药结核快速诊断技术

1、结核及耐药结核自动化检测技术2 Cepheid我国结核现状结核诊断新技术2015 WHO结核诊断指南更新2014年全球结核发病率来源：WHO 2015年工作报告2014年中国新发病例：8261552014年中国结核发病率：68/100 000近几年我国结核发病率逐年下降，但仍然属于结核高负担国家2014年全球耐药结核发病率来源：WHO 2015年工作报告新发结核病例中的耐药结核比例WHO估算2014年中国耐药结核发病数新发病例：43000复发病例：8200我国属于耐药结核 高负担国家高负担国家的耐药结核发现我国当前耐药结核防控的问题：不充分的耐药病人发现，不充足的耐药病人治疗5.56%纳入治疗

2、结核诊治出现偏差！n过多依赖X-光片或其他影像学检查，忽略了以痰标本为基础的微生物诊断n过多依赖未经验证、或不能作为诊断依据的测试，比如血清学检查n只参考传统的微生物检测结果因为这些检测的不可靠性，WHO 不得不采取非常规手段，特别提出反对这些测试的建议全球结核控制不理想的问题出在哪里？可诊断活动期结核感染无法区分活动期结核与潜伏期结核传统技术现代技术影像学涂片镜检培养皮肤菌素试验IGRA分子诊断结核诊断的常见技术n依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性敏感性为50%结核/非结核分枝杆菌不能区分（NTM可能占到40%）n以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响2个月才获得药敏结果，导致患者脱落

3、2个月后调整治疗方案，导致耐药患者的漏诊和传播n无法更早确诊耐药结核患者当前临床诊治的难点9 Cepheid我国结核诊断现状结核诊断新技术2015 WHO结核诊断指南更新结核诊断新技术 IGRA T-Spot QuantiFeron NAAT技术 等温扩增检测技术 线性探针 基因芯片 熔解曲线 巢式PCR 血清学检测IGRA原理：机体感染过结核分枝杆菌，T-淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时，产生和分泌特异性的细胞因子IFN-操作步骤：1.反转10次混匀2.37C条件下孵育16-24小时3.2000-3000g离心15分钟4.用移液管取血浆5.每个孔内放50ul结合液6.加入50ul血浆，室温

4、孵育120分钟7. 洗板至少6次8.每个孔内加100ul底物，室温孵育30分钟9.加入50ul反应终止液10. 450nm波长下读取吸光度11. 使用专用软件计算结果操作步骤：1.密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs）2.洗涤PBMCs3.将PBMCs与特异抗原一同加入到预包被抗-干扰素抗体的培养孔4.37C孵育16-20小时5. 洗涤培养孔6.加标记二抗7. 孵育1小时8. 洗涤培养孔9.加显色液10. 用蒸馏水终止反应11. 用肉眼判断结果QuantiFERON-TBT-SPOT.TB采血量：2岁儿童：2-3ml免疫力低下患者：6-8ml其他患者：4-6ml采血量：0.8-1.2m

5、l两者均有大量手工操作步骤，操作要求高QFT低采血量，更具优势IGRAIGRA适用于高收入、结核低负担国家的潜伏结核筛查在中低收入国家，尤其是结核高负担国家，不推荐使用IGRA将IGRA写入国家诊疗指南的有：美国、加拿大 、英国、法国、西班牙、德国、意大利、瑞士、荷兰、丹麦、挪威、芬兰、爱尔兰、葡萄牙、捷克共和国、斯洛伐克、波兰、保加利 亚、克罗地亚、澳大利亚、沙特阿拉伯、韩国、日本WHO的推荐欧美发达国家或/和结核低负担国家2011年，IGRA在中低收入国家的政策声明环介导等温扩增设备要求较低操作复杂，人工判读结果环介导等温扩增 中国CDC推荐可用于基层实验室 无耐药检测 WHO推荐对于持续

6、有肺结核症状的成人可替代涂片（条件性推荐）可作为持续有肺结核症状的成人的，可作为涂片的后续检测（条件性推荐）备注适用于可开展传统涂片的实验室不应当替代可检测结核和利福平耐药的快速分子诊断技术，尤其是耐药结核高危人群由于缺乏证据，TB-Lamp对于持续有肺结核症状的HIV患者的诊断价值，是否优于涂片尚不清楚TB-Lamp 的推荐只适用于检测持续有肺结核症状的患者的痰液样本TB-Lamp对儿童患者的检测由于缺乏数据，仅是推测恒温扩增 试纸条法操作步骤：1.将痰液液化、离心、灭活，制备成核酸扩增模板液2.取0.4ul移入1.5ml PCR管中，放入恒温装置中扩增3.使用水浴锅或金属浴；63扩增1小时

7、；4.将完成扩增的PCR管放入一次性防污染扩增物试纸条检测装置中检测, 15分钟目测定性结果无需昂贵的仪器无耐药检测手工操作相对较少WHO未评估或推荐恒温扩增 试纸条法WHO在2015工作报告新技术章节中提到该技术但说明目前该技术没有WHO评估并进行推荐所必须的多中心评估的数据实时荧光RNA恒温扩增检测技术RNA检测技术，高灵敏度，可区分活菌和死菌，适用于疗效监测需配备超声波仪，且仍需要实时荧光PCR仪检测无耐药检测WHO未评估或推荐手工操作步骤相对较少线性探针标本制备PCR反应杂交结果判读结果需要人工判读，或配备专门的设备WHO 2008年推荐用于涂阳标本检测MDR，2013年更新推荐检测二

8、线药物全程检测需6-8小时配套设备繁多，需3个房间，需PCR仪、杂交仪等手工操作步骤繁多，复杂的结果判读基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰液样本中结核杆菌的两种一线抗结核药耐药 利福平、异烟肼WHO未评估或推荐鉴定与药敏需用两套试剂盒，鉴定药敏各需6小时配套设备：需不同PCR室，需PCR仪、杂交仪、扫描仪等，需配备扫描仪及配套软件判读熔解曲线原理：一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定，发生错配时，Tm值下降，下降幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关2-3小时获得结果，目前通过CFDA的有利福平和异烟肼耐药两套试剂盒WHO未评估或推荐

9、配套设备：核酸提取仪、PCR仪等核酸提取扩增检测结果分子信标靶序列杂交体每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。PCR的目标是rpoB基因的81 bp区域： 5个探针结合到野生型，而不是突变体目标SPC半巢式实时荧光PCR（Xpert） WHO痰标本与处理液1：2混合吸取2ml处理样品到反应盒将反应盒放入检测模块（手工操作完成）标本自动清洗过滤超声裂解DNA提纯DNA和PCR反应试剂混合半巢式实时荧光定量核酸扩增检测打印检测报告获得检测结果时间：1小时45分钟系统内自动完成Its a development that the world has been waiting for, for

10、literally decades. Its something that has the potential of truly revolutionizing the way we deal with TB today.WHO Endorsement of Xpert MTB/RIFThe Test that is Changing the WorldDr. Mario Raviglione. Director, Stop TB, WHO 2011年WHO评估完成后正式推荐WHO全力推荐Xpert各类分子诊断技术比对（液体培养/DST为金标准） 线性探针基因芯片恒温扩增（试纸条法）RNA恒温

11、扩增LAMP熔解曲线Xpert MTB/RIF是否WHO推荐耐药结核诊断否否否否否结核及耐药结核初始诊断仪器通量12（手工）20或48（自动）6或12（选用杂交仪可同时做12个样品）单个通量取决于扩增仪纯手工操作961-80出报告时间6小时6小时2小时2小时2小时2-3小时2小时试剂储存条件部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻室温储存部分试剂需冷冻室温储存涂阳培阳样本MTB灵敏度无 无 84.1%5 84.6%6 98.2%7 80%898%3涂阴培阳样本MTB灵敏度无 无 59.8%5 61.9%6 55.6%7 81%868%3-88.8%2耐药灵敏度RIF：93.1%

12、-98%1INH： 85%3 RIF：91.8%-94.6%4INH： 70.2%-78.1%4 无无 无 RIF 95%31.陈琛等. 分子线性探针测定法杖结核病诊断中的研究进展. 中国防痨杂志. 2016(38): 218.2.Xichao Ou et al. A feasibility study of the Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Disease. 2015 (31): 41.3.WHO. Xpert MTB/

13、RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children Policy Update.4.Guo, Y et al. Rapid, accurate determination of multidrug resistance in M. tuberculosis isolates and sputum using a biochip system. International Journal of Infectious Disease. 2009 (13): 914.5.Xicha

14、o Ou et al. A multicenter study of Cross-Priming Amplification for tuberculosis diagnosis at peripheral level in China. Tuberculosis. 2014 (94): 428.6.黄芳等. 三种分子生物学诊断技术对结核诊断价值的比较. 中华结核和呼吸杂志. 2015 (38): 680.7.WHO. The use of a commercial loop-mediated Isothermal amplification assay (TB-Lamp) for the d

15、etection of tuberculosis. May 2013.8.王冰冰. 荧光PCR熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药检测中的临床应用. 国际检验医学杂志. 2015(35): 608. 文献：3种分子诊断方法比对无论涂阳培阳还是涂阴培阴，Xpert的检出率均最高样本：根据“结核病诊断和治疗指南”，收集2014年4-7月西安市结核病胸部肿瘤医院收治的经病理确诊或细菌性确诊的肺结核患者痰标本共378份。利福平耐药检测对MDR-TB诊疗足够吗？ INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的患者，无论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1。 约90%利

16、福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。1.Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831.2. Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral

17、level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.“结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限WHO推荐Xpert用于肺外结核的初始诊断样本类型对比（研究数，样本量）综合灵敏度 %（综合 95% CI）综合特异性 %（综合 95% CI）淋巴结组织与培养对比（14 项研究，849 例样本）84.9（72-92）92.5（80-97）与复合参考标准对比（5 项研究，1 篇未发表研究）83.7（74-90）99.2（88-10

18、0）脑脊液与培养对比（16 项研究，709 例样本）79.5（62-90）98.6（96-100）与复合参考标准对比（6 项研究，512 例样本）55.5（51-81）98.8（95-100）胸水与培养对比（17 项研究，1385 例样本）43.7（25-65）98.1（95-99）与复合参考标准对比（7 项研究，698 例样本）17（8-34）99.9（94-100）洗胃液与培养对比（12 项研究，1258 例样本）83.8（66-93）98.1（92-100）其他组织与培养对比（12 项研究，699 例样本）81.2（68-90）98.1（87-100）共纳入15项已发表研究和7项未发表研

19、究，涵盖5922例样本，大多数研究（59%）来自结核高负担地区。WHO推荐Xpert用于结核的初始诊断WHO 数据: 灵敏度66%, 特异性 98% 南非经验: 2011年6月-2012年5月，484 例患者, 年龄中位数24个月，痰液都是非诱导痰 63% 的样本体积132月）的儿童阳性率更高 Xpert MTB/RIF: 灵敏度 62.5% (25, 91), 特异性 99.1% (98, 99.9)涂片: 灵敏度 33% (8, 7)，特异性99.5% (98, 99.9)Xpert 检测儿童痰液，明显优于涂片；检测粪便标本性能同样优异痰 液粪 便易于使用的样本处理器 (0.6g, 1.2

20、g, 拭子)粪便（0.6 g）的性能和呼吸道标本效果相当，且非侵入式样本更适合儿童快速、即时的分子诊断实现检测就治疗韩国，国立首尔大学医学院2011年1月-2013年5月681例患者Xpert MTB/RIF可将从接诊到开始抗结核治疗的平均时间从21天缩短为6天南非全国使用Xpert逐步替代涂片，耐药结核负担明显下降2016 CATA, 南非NHLS优先项目负责人Wendy Stevens教授分享南非经验教授分享南非经验南非在矿区及矿区周边社区使用Xpert对重点人群进行筛查南非用Xpert检测肺外结核经验(约翰内斯堡研究，n=1175) Xpert 检出率是260/1175，与液体培养 相当

21、277/1175 Xpert 灵敏度59% (CI 53, 65) ，特异性92% (CI 90, 94). 脓、抽吸物的的灵敏度最高，然后是(腹水，然后是胸水).浓稠样本的灵敏度最高87% (CI 76, 94)，清液样本灵敏度较低 48% (CI 36, 61). 痕量血液不影响检测性能 52% (CI 44, 60) ，离心也不影响检测性能57% (CI 28, 82) Xpert 相比液体培养（10.5%污染），不容易受污染影响，同时可更早获得利福平耐药结果. Xpert检测脓和抽吸物的特异性低于呼吸道样本，但这些都是真阳性样本类型WHO 报告灵敏度 淋巴结组织和抽吸物85% CSF80%胸水44%胃液84%其他组织81%未来：Xpert Ultra 替代培养Xpert MTB/RIF 痰液的检测下限为50-165 CFU/ml，2小时出结果检测靶标：rpoB基因，5个探针检测突变，25 ul DNA用于PCR反应涂阴标本的灵敏度60-80%替代涂片的策略Xpert Ultra 痰液检测下限为 5-25 CFU/ml 新的样本处理试剂盒（