转番茄prosystemin基因的丹参抗虫性观察

1、转番茄prosystemin基因的丹参抗虫性观察 指导教师（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安，710100）摘 要 :原系统素( prosystemin)是系统素( systemin)的前体，它是与植物防卫反应相关的一种的多肽信号。研究表明，原系统素作为受伤诱导信号分子调节系统中的最初信号可以诱导蛋白酶抑制剂的合成，合成的蛋白酶抑制剂阻碍虫类体内消化酶发挥其蛋白水解作用来提高植株抗虫性。丹参为唇形科双子叶植物，它的根及根茎干燥后入药，主要功效有：活血调经、祛瘀止痛、养血安神等。在临床上用于高血压、心脑血管疾病等方面的治疗，并有显著效果。但是丹参的生长、药材的品质及产量均受病虫害影响较大，

2、本实验是利用转基因技术将番茄的原系统素基因转入丹参中，观察转入原系统素基因的丹参与野生型丹参的抗虫性比较并记录结果以便药用丹参有更广阔的发展空间。关键词: 原系统素；转基因技术；丹参；抗虫性1.文献综述 转基因技术又称基因工程，从上世纪80年代兴起至今，已有120多种转基因植物研发成功。例如转Bt基因水稻就是利用转基因技术培育的高产品种，转Bt基因后的水稻既能减少虫害又能提高产量，具有广阔的发展前景1。又如在1996年转基因抗虫棉的种植面积就已经近 900 万亩，在生产上有很好的发展态势，转基因后的棉花不但增强了对棉铃虫的抗性，还减少了种植过程中化学农药的使用，对棉花产业化有很大的推进作用2。

3、还有最近将拟南芥抗寒基因ICE1转入丹参，转化后的丹参具有较强的抗寒性，避免了由于低温而导致的丹参大量减产的现象3。此外还有许多抗病毒、抗逆性、改善观赏性等方面的转基因植物不断地问世。研发转基因植物所运用的转基因技术是通过对分子生物学技术的运用，人为的将特定的基因导入到试验生物体的基因组中，由于导入外源基因的表达，引起生物体性状的可遗传修饰4。通过转基因技术能使遗传物质得到改造的生物在营养、性状等各个方面达到对人类来说有更高价值的水平。这一技术在农业生产、动物饲养和医药研究等诸多领域被广泛地应用，得到了充分的认可，所以当天然物种中有些性状并不是人类所需的时候，我们就可以人为地、有目的地利用转基

4、因技术把不同的物种之间的高效基因进行重新组合成为新的生物物种5。本实验就是通过将番茄原系统素基因转入丹参中来提高其抗虫性进而改善因丹参虫害而导致的丹参药用成分质量和产量的下降。原系统素是系统素的前体，1991年Pearce等首次在番茄受伤后的叶片中分离出系统素，而后研究发现系统素在植物系统应答伤信号传导过程中起关键作用6。之后的科学研究中又有许多科研人员分别从龙葵、马铃薯、烟草和胡椒等植物中分离得到系统素。原系统素是由20个氨基酸组成的多肽物质。编码原系统素的基因是一种单拷贝的创伤信号基因，当植物受伤后此创伤信号基因会大量表达，从而使原系统素大幅增加生成更多的系统素7。近些年由原系统素介导的植

5、物防御反应的机制已成为研究的热点，有研究指出通常情况下，当植物受到外来的伤害或虫类啃食时会激活一系列防御性基因并大量表达，值得一提的是植物不仅在受伤部位近端产生这一反应，在受伤部位远端也有这种反应，这一系列的防御反应是受伤诱导信号分子调节控制的8。原系统素作为受伤诱导信号分子调节系统中的最初信号与茉莉酸相互作用来诱导蛋白酶抑制剂的合成。蛋白酶抑制剂是多肽类化合物，其分子量小，不但具有较广的抗虫谱系，而且性质很稳定，所以在植物体的抗虫过程中起重要的作用。原系统素与茉莉酸相互作用后合成的蛋白酶抑制剂主要靠阻碍消化酶发挥其蛋白水解作用进行抗虫，首先它与虫类消化道中的特异蛋白消化酶发生作用，合成抑制剂

6、和酶的复合物继而阻止消化酶发挥作用。因此，昆虫体内如果摄入含蛋白酶抑制剂的植物，那么昆虫体内的蛋白酶抑制剂就会发挥作用使昆虫摄入的食物无法消化，进而达到抗虫的目的9。番茄和其他一些茄科植物受到伤害时会引起蛋白酶抑制剂基因的系统表达，形成大量的积累，这作为一个模式系统来研究植物系统伤信号机制，目前已经被广泛应用10。系统素在伤信号近端转导过程是当植物受到伤害后该刺激会诱导原系统素基因的表达，生成的原系统素被各种剪切蛋白酶分解成系统素，然后受伤细胞中释放出较成熟的系统素作为细胞间信号物质。这一信号物质进一步的扩散与相应的受体结合来传递细胞的伤信号，这样就可以刺激防御系统相关的基因大量表达使植物产生

7、防御反应11。这一信号级联反应中系统素大量释放与膜表面受体结合后，再与质膜上系统素受体蛋白识别结合，进而使磷脂酶降解膜上的磷脂，而且十八烷酸途径中会生成茉莉酸及其衍生物，与之前产生的亚麻酸一起发挥作用，最终导致植物各种防御蛋白的表达12。但也有种假说认为系统素参与伤信号远端转导，其内容为原系统素经蛋白质剪切酶剪切后得到的系统素与由降解的细胞膜形成的茉莉酸一起从植物的受伤部位释放，因为两者都有系统移动的性质，所以在系统素刺激茉莉酸合成之后，系统素和茉莉酸一同在植物体中发挥信号传导作用，扩散的茉莉酸又可以刺激产生更多的原系统素然后剪切成系统素，这些系统素扩散后又可以放大植物体中的茉莉酸信号13。总

8、之，番茄原系统素基因对植物抗虫性起重要作用，所以番茄原系统素基因的相关研究越来越受到人们的重视。近年来有关转基因植物的研究越来越多，其中就有关于转番茄原系统素基因的例子。例如，2007年南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室的武亮等人对番茄的原系统素基因转化水稻抗虫性进行了研究。他们将番茄原系统素基因转入水稻，并没有出现预期结果，推测水稻中不存在类似于番茄中的系统素伤信号转导途径14。除此之外，2011年中国科学院植物研究所分子发育生物学研究中心的赵雪芹等进行了有关地上部特异性启动子驱动番茄原系统素基因表达的载体构建，最终得到了转番茄原系统素基因的植株15。以上都是转番茄原系统素基因的相

9、关研究，这里我们将针对提高丹参的抗虫性开展又一个转番茄原系统素基因的实验。丹参为唇形科双子叶植物，其根及茎干燥后入药，具有使冠状动脉扩张、 增加冠状动脉血流量、 防止心肌缺血和心肌梗死、 降低胆固醇和血脂水平，预防肝硬化等多种功效16。因此，丹参入药后在临床治疗心脑血管类疾病、高血压以及癌症等方面，有广泛的应用而且取得了显著的效果。丹参主要是含有脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类两种活性成分以入药17。随着丹参临床应用越来越广泛，市场需求量也越来越大，但是由于丹参野生资源有限，即使是人为生产其有效药用成分含量也很低，所以药用丹参的生产量不能满足临床应用的需求。因此近年来有许多研究都围绕着提

10、高丹参药用成分产量而展开。2012年中国中医科学院中药研究所张夏楠等人成功建立起适合丹参转基因毛状根离体生长的稳定转基因体系18。经研究发现由发根农杆菌感染植物形成的毛状根培养系统，能够显著提高丹参生长速度并且无需添加激素，还可以稳定生产并提高丹参药用成分含量，故毛状根系统是生产丹参药用成分的良好培养系统。同时为探索利用分子生物学技术培育新型药用植物的新途径，北京大学药学院陈海敏等人为改善或增加丹参的效用将白藜芦醇合酶基因导入丹参中并成功表达。他们利用白藜芦醇的药理活性，通过克隆葡萄玫瑰香和巨峰中的白藜芦醇合酶基因，构建组成植物表达载体，并将它导入到丹参基因组中，培育出高效表达白藜芦醇的丹参植

11、株，这样不仅可以利用生物反应器来大量生产白藜芦醇，还可以通过白藜芦醇和丹参在心血管防治方面的协同作用来增加丹参的疗效19。丹参的生长、药材的品质及产量均受病虫害影响较大，所以药用丹参的生产量不能满足临床应用的需求。例如地老虎、根结线虫等都对丹参有侵害。其中，根结线虫可以入侵丹参的根部，接下来由于根结线虫的作用使丹参根部细胞过快分裂增殖，造成根部肿瘤甚至死亡，不但影响地上部分生长还导致根部商品质量下降20；夜蛾对丹参的伤害一般是夏秋两季幼虫咬食叶片，严重时将叶片全部吃光，致丹参死亡；棉铃虫对丹参的影响主要是未成年幼虫钻食丹参花、果等部位最后影响种子产量21。但是目前对于丹参虫害的防治仍然停留在化

12、学农药水平，从人类健康和生态环境保护角度分析，一直使用化学农药会导致害虫不断产生抗性，施用农药的剂量和毒性也将不断增加，进而残留在丹参中的农药很可能影响丹参药用价值，而且大量使用农药还会引起环境污染，对生态环境造成严重破坏。所以利用化学农药抗虫显然不合理也不是长久之计。而转基因技术则可通过转入抗虫基因，提高丹参抵抗虫害的能力，从而避免或减少化学农药的使用，极大地改善丹参的药用质量和生态环境，国内外大量种植的转基因抗虫棉和抗虫玉米就是典型的例子22，本实验利用转基因技术将番茄的原系统素基因转入丹参中以提高丹参的抗虫性，为抗虫丹参产业化发展奠定基础。2. 实验材料：丹参（CK株系）2-3个月实生苗

13、真叶3-5片（每个株系取至少3个不同个体作为生物学重复），丹参P-5株系，尽量选取同一部位（如顶叶或第二对真叶等)；同时应注意叶片的生长情况尽量一致。棉铃虫：3龄幼虫若干，由西北农林科技大学植物保护研究室馈赠。棉花、纱布、平皿、毛笔、镊子、光照培养箱、记录本3.实验方法：（1）将购买来的正常棉铃虫放置在培养箱中培养一周，待棉铃虫情况稳定后开始实验。（2）准备8个相同的平皿编号1-8，然后分别用湿润的棉花平铺在平皿中，上面蒙上一层纱布平整的铺开，将丹参P-5株系的叶片放置于1-4号平皿中铺平，5-8号放置丹参CK株系叶片，尽量保证两株系叶片生长情况一致。（3）用毛笔在棉铃虫培养基中挑选3条长势相

14、近3龄棉铃虫于平皿内的叶片上均匀放置，盖上盖子，用封口膜封口。（4）将平皿放在25度培养箱中培养，每隔24小时观察一次棉铃虫的生长情况并记录，计算死亡率以及叶片受损情况。叶片损害程度鉴定：I级受害呈针头状，不连片。II级受害成小片，但不超过叶片面积的1/4.III级受害连成片，受害面积超过叶片的1/4但不足1/2.IV级受害连成片，并超过叶面积的1/2死亡率=死虫数/总虫数×100%4. 实验结果与讨论4.1丹参CK株系和P-5株系上棉铃虫体长随时间的变化 将3龄棉铃虫放入平皿中后，每24小时测一次棉铃虫的体长，并且计算出每个平皿中棉铃虫的平均体长然后记录，见表1。表1 丹参CK株系

15、和P-5株系棉铃虫体长随着天数的变化值天数体长(mm)丹参CK株系丹参P-5株系D18.33±0.036.00±0.05D27.83±0.025.25±0.04D37.00±0.034.25±0.05 绘制丹参CK株系和P-5株系棉铃虫体长变化曲线并比较，如图1。 图1 丹参CK株系和P-5株系棉铃虫体长变化曲线由以上数据表格得到的变化曲线，比较两条曲线的变化率丹参P-5株系的斜率为0.8750而丹参CK株系的斜率为0.6650，说明随着时间的不断推移，丹参P-5株系上的棉铃虫体长的平均值下降的更快，即丹参的P-5株系上的棉铃虫生长态

16、势较CK株系上的棉铃虫弱。进而说明丹参P-5株系较丹参CK株系不适合棉铃虫生存而且对棉铃虫生长有明显的伤害作用，也就是说我们转入番茄原系统素基因后的丹参P-5株系较野生型抗虫性明显提高。4.2丹参CK株系和P-5株系上棉铃虫数量随时间的变化 将3龄棉铃虫挑选后分别放入平皿中，每个丹参株系的平皿中放置12只棉铃虫，每24小时观察一次两种株系的叶片上棉铃虫的剩余数量并记录，见表2。表2 丹参CK株系和P-5株系上棉铃虫随时间变化的剩余数量天数虫数 丹参CK株系 丹参P-5株系D01212D1125D2104D342根据记录的数据，绘制从棉铃虫放入平皿后丹参CK株系和P-5株系上棉铃虫剩余数量随时间

17、的变化柱状比较图，如图2。 图2 丹参两株系上棉铃虫剩余数量随时间变化柱状比较图如图所示，深色部分代表丹参P-5株系上剩余的棉铃虫数量，浅色部分代表丹参CK株系上的棉铃虫剩余数量。两株系上棉铃虫起始时数量相同，均为12只，一天后，丹参CK株系上的棉铃虫数量无变化，而丹参P-5株系上棉铃虫大量死亡，仅剩5只，所以相对CK株系而言P-5株系对棉铃虫有明显的伤害作用。三天后，CK株系的棉铃虫数量骤减，分析是丹参叶片被啃食严重，棉铃虫无叶片可食所致。由此可以看出，转入番茄原系统素基因后的丹参P-5株系较野生型丹参CK株系抗虫性明显提高。4.3丹参CK株系和P-5株系上棉铃虫死亡率随时间的变化将3龄棉铃

18、虫挑选后放入平皿中，每个丹参株系的平皿中放置12只棉铃虫，每24小时分别观察两种株系叶片上棉铃虫的数量，然后计算死亡率（死亡率=死虫数/总虫数×100%）并记录，见表3。表3 丹参CK株系和P-5株系上棉铃虫死亡率及平均值天数死亡率（%）丹参CK株系丹参P-5株系D10%58.3%D216.7%66.7%D366.7%83.3%平均值27.8%69.4% 由上表中的平均值绘柱状分析图比较两株系死亡率，如图3。图3 丹参CK株系和P-5株系上棉铃虫死亡率平均值柱状比较图分别记录观察期间丹参两个株系上棉铃虫的死亡情况，并计算得到每个株系的平均死亡率。丹参CK株系和P-5株系的死亡率分别为

19、27.8%和69.4%，丹参P-5株系的死亡率远远高于丹参CK株系，说明转入番茄原系统素基因后的丹参P-5株系较野生型丹参CK株系抗虫性明显提高。4.4丹参CK株系和P-5株系的叶片受损情况随时间的变化将3龄棉铃虫挑选后分别放入平皿中后，每24小时鉴定一次株系的叶片受损程度，并且计算出每个平皿中的叶片的平均受损程度并记录，见表4。 表4 丹参CK株系和P-5株系的叶片受损程度平均值天数叶片受损程度丹参CK株系丹参P-5株系D121.33D23.331.67D33.671.67 根据表4绘制丹参CK株系和P-5株系的叶片受损程度平均值的柱状比较图，如图4图4 丹参两个株系的叶片受损程度柱状比较图

20、 如图所示，深色部分代表丹参P-5株系叶片受损程度，浅色部分代表丹参CK株系叶片受损程度。通过图表可以看出丹参CK株系叶片受损程度较为严重，而丹参P-5株系的叶片受损程度较轻。并且丹参P-5株系的叶片在第一天后受损程度平均值变化不大，分析是由于其上棉铃虫啃食了P-5株系的叶片后生长态势明显下降甚至死亡。这都说明转入番茄原系统素基因后的丹参P-5株系较野生型丹参CK株系抗虫性明显提高。下图为实验开始观察后第3天拍摄的丹参CK株系和P-5株系的叶片。如图5。 图5 左图为丹参CK株系叶片 右图为丹参P-5株系叶片 从上图明显可以看出，叶片在被啃食三天后，丹参CK株系叶片上的棉铃虫较丹参P-5株系上

21、的棉铃虫生长状态良好，体积较大。而且丹参P-5株系叶片的受损程度为明显小于丹参CK株系叶片的受损程度，这也可以说明其上的棉铃虫生长态势较弱。以上实验结果说明转入番茄原系统素基因后的丹参P-5株系较野生型丹参CK株系的抗虫性明显提高。【参考文献】1 韩庚辰. 我国转基因玉米产业化的机遇与挑战J. 创新生物经济环境, 培育战略新兴产业第四届中国生物产业大会· 2010 海峡两岸重大生物技术产业化论坛会刊, 2010.27-28.2汪若海, 李秀兰. 我国转基因抗虫棉应用现状及建议J. 生物技术通报, 2000 (5): 1-6.3李晋. 拟南芥抗寒基因ICE1转化丹参的研究D.陕西师范大

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27、g Zhezhi(College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119)Abstract:Prosystemin is the precursor hormone of system,It is a signal peptide associated with the plant defense response.Research shows that, Prosystemin as the initial signal in injury-induced signaling molecules regulat

28、ing system interactions with jasmonate to induce the synthesis of protease inhibitors, Synthetic protease inhibitors may hinder insects digestive enzymes in vivo proteolysis play its role to improve plant resistance to insects. Salvia miltiorrhiza Labiatae dicots, its roots and rhizomes dried medicine, the main effect there, blood to regulate menstruation, blood stasis and relieve pain, nourishing the nerves and so on.Used in the clinical treatment of hypertension, cardiovascular disease, etc., and have a significant effect.