PCR技术教程PPT课件

1、一、PCR技术二、定量PCR技术三、数字PCR技术第1页/共71页一、PCR原理Polymerase Chain Reaction(PCR)：在体外特异性地扩增某个基因。1、历史1971年，Khorana提出体外人工复制DNA的设想。1985年Cetus公司科学家使设想变成现实，采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37），并获1993年诺贝尔化学奖。1988年R.K. Saiki 应用Taq DNA聚合酶（水生栖热菌）于PCR反应；同年，Cetus公司发明自动热循环仪。第2页/共71页2、原理预变性变性退火延伸保存循环（30次）95预变性1 min95变性 1 min目的：DNA双链成单

2、链56退火目的：引物先与模板匹配72延伸1-2 min 目的：聚合酶在引物3端加核苷酸，合成新链12保存循环特异性强、灵敏度高、快速、简便第3页/共71页循环次数DNA数量122438201048576301073741824第4页/共71页1、Taq酶：具有53聚合酶和外切酶活性，无35外切酶活性，不能修复错误的碱基配对，因此必须测序。需激活剂：Mg2+ 2、pfu DNA 聚合酶：有53和35外切酶活性，出错率最低，但PCR产物平端。3、Taq Plus DNA 聚合酶：是Taq和pfu的混合物，Taq PCR产物3端带A。4、引物：互补；引物长度；3碱基序列必须与模板配对；尽量提高GC含

3、量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引物二聚体。5、Tm=(G+C)4+(A+C) 26、primer 5.07、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100l）8、dNTP浓度2.5 mM each特殊说明：第5页/共71页普通PCRRT-PCRTAIL-PCR Real-time PCR数字PCRPCR类型：第6页/共71页普通PCR仪梯度PCR仪原位PCR仪定量PCR仪数字PCR仪第7页/共71页二、实时荧光定量PCR（Real-time quantification PCR）1、历史实时荧光定量PCR技术于1996年

4、由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它的特异性更强、更能有效解决PCR污染问题、自动化程度更高等特点。第8页/共71页第9页/共71页原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如Taqman探针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，再通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。也就是通过荧光的变化，获得不同样品达到一定荧光信号（阈值）所需要的循环次数Ct（Cycle Threshold）。 Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经

5、历的循环数。第10页/共71页1、荧光探针和荧光染料：分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高，后者操作简单。SYBR GREEN 1：结合双链DNA小沟后，荧光强度增强，但也会结合引物二聚体或单链引起的二级结构。变性时，双链分开，荧光消失。特别说明：TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5端，淬灭基因连在3端。5端荧光基团吸收能量后转移给临近的3端淬灭基团，发生共振能量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。第11页/共71页荧光定量PCR的优点1.荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增；2.灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量；3.既能用于定性，判断一段

6、DNA序列的有无，也可用于定量，确定起始DNA拷贝数。第12页/共71页一对引物引物之间一条寡核苷酸，即探针报告基因与淬灭基团完整探针，不发光；水解后，发光。FRET第13页/共71页变性（95）退火（60）第14页/共71页DNA聚合酶第15页/共71页53外切酶活性；可将探针5端的荧光基团切割下来。第16页/共71页荧光基团游离下来后发光了！第17页/共71页第18页/共71页因为探针是完全与目的基因互补，当它被水解后就发光，因此发光的强度与目标基因量成正比。第19页/共71页只与双链结合，发光；不与单链结合，不发光。第20页/共71页第21页/共71页随温度升高，DNA双螺旋结构降解程度

7、的曲线即熔解曲线，熔解曲线，可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解。 染料法做，探针法不做第22页/共71页不适合染料法第23页/共71页第24页/共71页卤素灯（白光）第25页/共71页定量线性图与对数图正好相反，基线期在对数图中增高。第26页/共71页第27页/共71页基线荧光阈值Ct值DNA0基线：扩增线中的水平部分，由环境的噪音产生。实验结束软件自动分析数据，基线取默认值3-15（循环数）。如果最小的Ct值18，保持默认；如果最小的Ct值18，基线终点

8、改成最小的Ct值减3，重新分析。第28页/共71页荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。默认阈值基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。第29页/共71页Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。DNA0：样本起始DNA浓度。第30页/共71页第31页/共71页理论上PCR是一个指数增长的过程，但实际的PCR扩增曲线并标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR因素逐渐不满足要求，PCR效率越来越低，产物增长的速度逐渐减缓。第32页

9、/共71页第33页/共71页第34页/共71页绝对第35页/共71页第36页/共71页处理与对照第37页/共71页第38页/共71页定量PCR仪特点，污染机会少第39页/共71页定量PCR的实验因素DNA纯度：OD260/OD280=1.8, 1.6-2.0之间DNA用量：0.05-100ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1l样品和标准品都需要重复，重复次数遵循统计学要求。第40页/共71页定量PCR实验要素：目标基因：未知样品生成标准：曲线标准品梯度监控系统：阳性对照监控污染：阴性对照校准生物学误差：管家基因校准物理误差：参比

10、荧光（ROX）降低其它误差：重复实验第41页/共71页ABI750096孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观。ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）耗材质量（如管盖厚度、透光性）仪器稳定性（如孔间、批间温度波动）第42页/共71页第43页/共71页Real-time PCR 方法的应用绝对定量（Absolute Quantification）：拷贝数；标准是已知拷 贝数的质粒DNA。相对定量（Relative Quantification ）：相对变化量；内标定量。前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100%且 偏差在5%以内。第44页/共71页第45页/共71页第46页/共71页蛋白互作第47页/共71页第48页/共71页第49页/共71页第50页/共71页第51页/共71页第52页/共71页三、第53页/共71页第54页/共71页第55页/共71页第56页