RNA的防护：CRISPRs保护原核生物免受移动基因元件

1、 RNA的防护：CRISPRs保护原核生物免受移动基因元件（第2组翻译人员：黄亚宁，李淑娟 字秋艳，陆晓媚 ，匡双便，徐蕾 ）摘要：在原核生物中CRISPR/Cas 体系提供了对入侵病毒和质粒的抗性。在机制中有三个明显的阶段已经被识别。首先，入侵的片段DNA作为间隔区(spacer)整合到重复的CRISPR位点。随后，CRISPR被转录，而转录物被Cas蛋白反复地裂开，生成短包的RNA（crRNA），crRNA含有spacer序列。最后，crRNA指导Cas蛋白机械mechiery到互补的入侵目标，或是DNA或是RNA，从而抑制病毒后质粒的增值。这篇文章，我们讨论了现在已经了解到的这种神奇的具

2、有遗传性的防御系统，并描述与真核生物中RNAi功能的相似性和区别。大纲：1 引言 2 CRISPR位点和Cas基因3 作用方式 4 与真核生RNAi的类比5 结论 参考文献1 引言 通过有移动遗传元件的基因材料的连续性交换，来显著地影响到质量和数量的微生物的进化。病毒存在于地球上大多数丰富的实体中（Bergh等人1989；Wommack和Colwel等人2000），他们通过一系列的活动来进行扩增：病毒吸附到宿主的细胞壁，穿过细胞膜注入病毒基因组（DNA或RNA），病毒基因组的表达，病毒基因组的复制以及病毒蛋白衣的组装，最后是子代病毒的释放（Sturino 和 Klaenhammer，2004）

3、。质粒是另外一种独立的可移动元件。质粒进入到宿主寄主后，或是游离在细胞质或是作为宿主基因组的整合序列。质粒可以通过结合作用从供体细胞转运到受体，利用专用的转移系统（Llosa等人。2002）。尽管偶然功能的获得是水平基因转运的结果，与可移动元件的重组也可以引起严重破坏（或是结构上的破坏或是宿主基因组的调控区域导致的功能丧失）。另外，噬菌体感染可能最终导致宿主细胞的裂解。为了避免这些有害的影响，复杂机制进行演变从而防御宿主生物体核酸受可遗传性元件的入侵。几种防御系统已经认识了，原核生物中的免疫系统与真核生物有很大不同。一个被动式防御机制可以作用在病毒粒子吸附的水平或是注入它的遗传物质。宿主中病毒

4、受体蛋白的自发突变可以扰乱病毒的附着和遗传物质的注入，但不应先感到宿主的健康，比如说，但大肠杆菌的麦芽糖孔蛋白使用-噬菌体（197）。而众所周知的主动防御机制是限制性-修饰（R-M）系统。专一的甲基化转移酶类修饰了宿主DNA中可能破裂的位点，防止被限制酶解链。引入外来的DNA缺乏这些修饰，因此可以被内切酶有目的的消化（回顾, Tock和Dryden，2005）。额外的作用机制呈现了与真核生物细胞凋亡的功能相似性，这个机制是原核生物失败的感染机制（Abi）。这个机制抑制噬菌体的增值，或是通过阻塞噬菌体的复制机构或是通过抑制宿主的翻译。这个结果是宿主和病毒都死亡，它们的牺牲保全剩下的躯体（Chop

5、in等人。2005）。 近年来，另外一个防御机制已经被发现，这个机制是基于集群规律性穿插短回文重复序列（CRISPRs）和CRISPR关联的基因（cas基因）。CRISPR/Cas体系可以将来自入侵的可移动元件的核酸片段整合到短的成熟RNAs（crRNAs）.这些crRNAs特定地指导Cas的蛋白机构到它们互补的目标：或是来自侵入的病毒或质粒的DNA或是RNA。因此，CRISPR/Cas体系可以提供宿主获得可遗传的抗性（回顾Sorek等人。2008; 先人Oost等人。2009; Horvath和Barrangou 2010; Karginov和Hannon 2010;Marraffini和S

6、ontheimer2010a）。这篇文章，我们叙述了CRISPR/Cas体系作用机制的特征，并讨论了与真核生物RNA干扰的相似处和不同之处。2 CRISPR位点和Cas基因CRISPRs在1987年首次发现，当一个来自大肠杆菌K12的染色体片段被测序（Ishino等人。1987）。从那以后，许多CRISPR序列在真核生物中被识别（概述看：http:/crispr.u-psud.fr/crispr/CRISPRdatabase.php）。CRISPRs中48%的细菌组的序列已经被检测出，其中95%的序列为古细菌的基因组。 CRISPRs由一簇相同的重复序列组成，这些序列被不全相同的相似长度的间隔

7、序列分开（见后面的讨论）。CRISPR的排列常常是在前面的是多达500个碱基对的富含AT的引导肽序列（Jansen等人。2002）。每个基因组CRISPR位点的数量冲1到20，长度变化从很小到上百的重复间隔对。目前最长记录是绿弯菌属的CRISPR，有374重复序列和间隔区。CRISPR12种主要的类型已经被提议，以重复序列的相似性为依据（Kunin等人。2007）。重复序列的大小变化从24到47bp，因此，间隔区的大小从24到72bp。这个重复序列和间隔区的大小典型地在30bp左右。一些重复序列有编码潜在牢固二级结构的CRISPR RNAs的回文序列，因此，其他序列似乎缺少这种序列（图1B）。

8、每一簇主要和一种Cas的亚型相关，在后面讨论。在2005年，三个不同的研究小组独立地观察到至少一个间隔序列的子集是与噬菌体和质粒DNA序列是相同的（Bolotin等人，2005; Mojica等人，2005; Pourcel等人，2005）。匹配间隔序列的病毒或质粒片段叫做原间隔（Deveau等人，2008）。来源于病毒序列的间隔序列导致了假设，即CRISPR/Cas体系可能涉及到原核生物对外来核酸的抗性（回顾Makarova2006）。CRISPR的组成是超变量，在宿主环境中快速地被染色体外的元件所塑造（Lillestol等人，2006; Andersson和Banfield 2008; T

9、yson和Banfield 2008; Banfield和Young 2009; Held和Whitaker 2009; Lillestol等人，2009）。染色体外的元件通过广泛基因转移轮流响应（Andersson和Banfield，2008）或通过突变（Deveau等人，2008; Heidelberg等人，2009; Semenova等人，2009;Ploeg，2009）来避免CRISP的防御机制，说明宿主和捕食者的正在作斗争。 图1：所有在这篇文章中描述的4中亚型的CRISPR/Cas，所有的八种CRISPR/Cas参见Haft等人05年和Van der Oost等人09年的文献 A：

10、在四种试验研究过的生物中cas基因临近结构示意图，每一种都用框图代表一种亚类型。CRISPR由灰矩形代表的leader，红方块代表的重复子，还有蓝矩形代表的spacer。只显示了一种CRISPR的片段。基因用箭头指出，蓝色箭头指出基因有可能涉及到spacer需求。黄箭头指出基因涉及到CRISPR转录，处理和目标干涉。核酸内切酶剪切前crRNA生成crRNA这个过程用Blod箭头着重标出。Hatching pattern指出基因的相似性：RAMP基因拥有纵线，聚合酶基因拥有横线，CasC同源物有虚线(diagonal lines)其他无关紧要的基因都涂满颜色。构成CasC复合体的基因用下划线标出

11、。B:各种生物中的CRISPR Rna重复序列在此给出。酶切点位用三角形标出，经管重复序列不尽相同，所有CRISPR RNA酶切事件产生一个八核苷酸的5'端柄。请注意，在Streptococcus thermophilus中的CRISPR RNA酶切没点还没有被证实。回文结构用下划线标出。就如早先Kunin等人研究过的一样，P.furiosus中的序列并不像能够形成茎环结构的样子。C:预测不同 CRISPR RNA 的重复序列的二级结构。切割位点用箭头指示。如前面库宁等人所描述的，古菌P. Furiosus的重复是不可能形成一个颈环结构（库宁等人，2007）.b这个最佳保守cas基因是

12、呈现在所有亚型的cas1和cas2（Haft等人，2005）。因此，他们是目前适合CRISPR/Cas的标记。假定的核酸酶/整合酶Cas1（Makarova 等人，2006）作为一个需要金属离子的核酸酶已经被说明，这个核酸酶可以裂解ssDNA和dsDNA，从dsDNA中裂解约80bp长度的DNA片段。Cas1结构揭示了一个具有两个区域体系的异常的折叠（Wiedenheft等人，2009）。小的Cas2蛋白从富含U区域裂解ssRNAs。解决了来自几个物种的Cas2的晶体结构，揭示了铁氧还蛋白折叠，对于内切核糖核酸酶而言是很不平常的（Beloglazova等人，2008）。认为Cas1参与了间隔区

13、的整合（Makarova等人，2006）。预测当间隔区已经存在于CRISPR阵列时，大肠杆菌中的Cas1和Cas2不参与抗病毒作用机制的防御阶段，这个预测与观察是一致（Brouns等人，2008;Hale等人，2009）。在几个基因组中包括Geobacter sulfurreducens的基因组，Cas1与Cas4基因的融合说明Cas4，一个类似RecB的核酸酶超敏感位点（Makarova 等人，2006），可能也参与了间隔区的获得（Oost 等人，2009）。Cas3是一个特殊的例子，是一个典型的单一的多肽，由2个区域组成：一个DH区域，在双链寡核苷酸中有一个依赖金属离子的核酸酶活性（Ara

14、vind 和 Koonin 1998; Han和Krauss，2009）和一个DEAD/H盒解旋酶区域（Makarova等人，2006）。有趣的是，在Cas亚型这些区域是分隔的，并且在Cas亚型中Cas3与Cas2融合（Makarova等人，2006）。Cas5和Cas6，以前解释为核心Cas蛋白，表示一类远离相关Cas蛋白，作为RAMPs涉及到。他们似乎有相似的3D结构，并共享至少羧基末端富含甘氨酸的环（Makarova 等人。2002）。两个RAMP蛋白(CasE and Cas6)最近发现是一个不依赖金属离子的内切酶，这个内切酶参与到CRISPR RNA (pre-crRNA)的加工，后

15、面有描述（Brouns 等人，2008; Carte等人，2008）。另外，最近发现了由多个亚基组成的Cas复合物的两种类型。在大肠杆菌中，一个复合体是由5个基因簇cse14 and cas5e（Cas5e and Cse3是RAMPs）编码的，并且这个产物形成了一个Cse复合体称为Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defense，CRISPR关联的抗病毒复合物) (Brouns等人，2008)。一个crRNA-结合Cmr-复合体包含Cmr-6已从火球菌属中分离出来(Hale等人，2009)。对实验性地确定和假设的内容以及核心Ca

16、s蛋白和Cas复合体的描述见表1.3 作用方式 这CRISPR/Cas机制可以分为三个不同的阶段。第一阶段涉及整合入侵移动遗传元件的核酸片段作为一个新间隔区进入CRISPR位点。第二阶段，这CRISPR作为一个前导体（前导-crRNA）转录，随后被一个直接的内切核糖核酸酶清除，导致成熟的crRNA仍然和一个Cas蛋白复合体相联系。在第三和最后一个阶段，crRNA指导Cas复合体了解和侵入核酸去中和侵入者，主要是通过分裂。 3.1 新间隔区的整合 第一个实验证据表明，从噬菌体侵染乳酸菌嗜热链球菌实验中可以得出这 CRISPR/Cas系统确实是一个抗病毒防御系统，它有一个Csn-亚型的CRISPR

17、/CAS位点（图1A）。筛选那些在幸存的细菌中适应CRISPR位点细菌表明一个族群的幸存者获得了一个新的噬菌体专一性的间隔区片段(图2)。随后删除这些新的间隔序列造成获得性抗性的损失，表明间隔存在和噬菌体抗性的相关性。比较分析间隔区目标区域的病毒基因组表明一个序列基元叫做CRISPR基元或原-间隔区下游的原-间隔区邻近的基元（PAM）。噬菌体不仅通过原-间隔区的突变响应寄主的抗病性，而且通过在基元的突变，说明噬菌体和细菌间持续的斗争。间隔区没有一个完美的PAM,间隔区也不是完整的，但是这些经常伴随着有一个完美的PAM的间隔区，后者对于抗病性可能是必须的。数据表明PAM对于目标干扰是重要的，但对

18、于新间隔区的整合不重要。遗传分析原-间隔区表明，PAM在许多染色体外的元素中存在轻微的不同，并且这PAM序列的保守性与CRISPR重复类型有关，因此，也与cas基因亚型有关。图2：新插入子的聚合。在病毒感染期间一个新的插入子在CRISPR的leader proximal方向被请求。CRISPR有leader灰框，repeat红方块和蓝框的spacers组成。最新请求的spacer是0号和互补病毒的序列(原插入子)，原插入子毗邻基元(PAM)位于原插入子的上有或者下游。 嗜热链球菌的间隔区被集成在CRISPR位点的近端，表明一个CRISPR系列序时记录了过去的噬菌体侵染。前导序列的左右还不清楚，

19、但是它可能需要重复复制和或间隔整合。先前Lillestol和他的同事通过比较两个硫化叶菌菌株的CRISPR在CRISPR的主要一侧的重大变化来预测CRISPR整合的极性。接着，在嗜热链球菌的间隔整合获得抗病性，上面提到的研究也表明cas基因也涉及CRISPR-调解防御。csn1基因的破坏导致病毒抗性的缺失。一个中性的csn2基因不会导致抗性的消失，而是有一个对整合的新的间隔区有分裂的能力。这表明全部的cas基因不仅与抗性有关，而且在不同的阶段还扮演着重要的作用。cas2 基因表面上作用于新的间隔区的整合，但它被Cas-亚型限制。产琥珀酸沃廉菌，携带着相同的亚型，cas2基因缺失并且似乎被cas

20、4基因替代。因此，尽管还不知道Cas2在间隔区整合中的作用，但它似乎被其他Cas亚型的具有类似的功能的Cas蛋白质替代，Cas4正是作为一个可能的候选者。Cas1可能有一个和Cascade/ Cas3(正如后面讨论的，Cas3也涉及目标干扰)类似的功能。3.2 CRISPR转录和加工之前，人们做出假设：CRISPR/Cas系统保护宿主免受核酸入侵，对在古菌Archaeoglobus fulgidus和 S. solfataricus 中的短RNA的研究表明CRISPRs可以激活转录并可对pre-crRNA进行加工(Tang 等人 2002; Tang 等人 2005)。在对古菌S. Solfa

21、taricus的转录和加工的研究表明，转录可以是双向的 (Lillestol 等人 2006; Lillestol 等人2009)，大多数其他的研究表明在前导的近侧端有单向转录(Brouns 等人2008; Hale 等人 2008; Marrafni and Sontheimer 2008; Semenova等人 2009) 。 因此预计，在大多数情况下，在前导侧位置的单一启动子控制CRISPR位点的转录 。最近研究表明在一定的情况下大肠杆菌K12启动子确实位于前导区(Pul 等人2010)。在更详细的大肠杆菌K12系统中对CRISPR 的转录和表达已经进行了研究，这个系统是由8个Cas基因

22、上游的CRISPR组成的(Fig. 1A)。Cas蛋白在大肠杆菌BL21中是过表达的，而菌种BL21是缺乏内源性的Cas基因的菌株(Studier 等人 2009)。进一步分析表明存在级联，这个蛋白复合体包括五个不同的亚基，CasABCDE。对大肠杆菌K12的crRNAs进行Northern杂交分析发现了短RNAs，它的大小相当于约为一个间隔区和一个重复。省略对Cas基因中每个基因进行鉴定，只鉴定CasE基因，一个RAMP蛋白质，在前-crRNA的加工中作为一个潜在的候选者。这一发现在体外实验中被证实，实验表明 CasE 是一个金属独立性核酸内切酶，这种酶可以特异性切割pre-crRNA为成熟

23、的 crRNAs。经加工后，这些crRNAs主要紧密结合在级联复合体上。克隆和后续的序列分析表明多数 crRNA 产物是源于CRISPR前导的近侧(Brouns等人 2008)。对P. Furiosus的crRNA的独立分析也发现了许多源于CRISPR前导近侧的产物，并且少量产物来自于前端。这可以解释由CRISPR 转录过早终止而导致的(Hale 等人2008)。克隆的大肠杆菌的crRNA产物的序列分析表明：该产物含有8个核苷酸的重复，这被称为5端的手柄，间隔区，和下一个重复的大部分包括一部分称为茎-环结构的3端手柄(Brouns等人 2008)。这些手柄的提出证实了crRNAs的保守部分是通

24、过亚基的级联约束的(Brouns 等人2008)。基于CasE序列的保守性和源于古菌Thermus thermophilus的同源性的CasE的晶体结构(Ebihara等人2006)，在20位的组氨酸残基被预测是参与核酸内切酶活性的残基。事实上，当组氨酸被丙氨酸取代时，该酶的活性就会丧失。体内分析表明，突变导致的抵抗能力丧失，从而揭示前-crRNA的裂解是一种机械需求。尽管P. furiosus 的Cas6 享有较低的序列同源性（此外，羧基末端富含甘氨酸的循环，一种RAMP蛋白质的常见功能），一个重复的铁氧还蛋白的折叠的结构与来自古菌T.Thermophilus的CasE是惊人的相似(Fig.

25、3) (van der Oost等人 2009)。诸如CasE, Cas6 显示金属独立性核酸内切酶的活性(Carte等人 2008)。虽然，P. furiosus 的重复的 RNA的折叠的二级结构是有争议的(Kunin 等人 2007)，但它的crRNA的裂解产物仍包括一个八核苷酸的5手柄(psi-tag) (Fig. 1B and C)。不同于CasE中提出的单组氨酸位点(Brouns 等人 2008)，一个潜在的组氨酸、酪氨酸和赖氨酸残基的催化三联体是存在于Cas6 中(Fig. 3) (Carte等人2008)。该预测的催化位点是结构类似于 tRNA 剪接酶的结构。裂解前crRNA的产

26、物分析表明，切割发生在磷酸二酯键的3端处，产生一个5末端的羟基基团和一个2，3端的环状磷酸酯基，类似氨酰tRNA 剪接酶(Calvin and Li 2008; Carte 等人2008)。CasE 和Cas6可能根据一个一般的酸碱水解机制来进行裂解前crRNA(Fig. 3c)。除了其核糖核酸内切的活性，Cas6结合crRNA的3手柄。然而，在古菌P. Furiosus，核糖核酸内切产物进一步修剪为活性的成熟的缺乏3手柄的crRNAs(Hale等人 2008; Hale 等人2009)，而在大肠杆菌中成熟的crRNAs则含有3手柄。另一个区别是事实上CasE仍然是级联复合物的一部分(Brou

27、ns等人2008)，而Cas6作为古菌pyrococcal 的Cmr复合物的部分却不能被确认(参考以下内容) (Hale等人2009)；显然，裂解古菌P. furiosus 中crRNAs是通过Cmr复合物来转移的。除了Cmr复合物，一个额外的Cst复合物可能在古菌 P. Furiosus中出现，它是通过三个cmr模块中cst基因下游基因所编码的（Fig.1A）。总的来说，尽管一些机制的类相似性现在已经很清楚，但在CRISPR/Cas的不同亚型之间也存在很大的差异。 图3：CasE和Cas6的催化活性中心，和被怀疑的原crRNA剪切反应机制：A：从T.thermophilus中分离的CasE疑

28、似的催化活性中心显示了保守的组氨酸残基（26号位的组氨酸），和富glycine的羧基端环状结构 B：从P.furiosus中分离得到的Cas6含有31号位Tyrosine，46号位组氨酸和52号位Lysine，还有富含Glycine的羧基端环状结构。环状结构和总体上duplicated的ferredoxin fold(这个跟铁有关)，在CasE和Cas6中都是保守的，原crRNA剪切可能缘于产生酸碱水解反应。C：碱从核糖环2号位的羟基上放弃一个质子。随后对于磷原子的亲和攻击时同时被酸所抵消，供应一个质子以离开3端RNA。Cas6的Tyrosine残基被怀疑作为碱而组氨酸残基作为酸。在CasE中

29、，组氨酸和水分子可能作为催化残基。A和B的图片用pymol生成，潜在的催化残基涂成蓝色，富glycine环状结构被涂成红色。资料来自于蛋白质数据库3.3 目标干扰虽然这是最初的猜测,这一CRISPR /Cas系统的目标异性RNA类似于RNAi(Makarova 等人. 2006),一些研究表明,CRISPR系统的目标是被入侵的DNA。第一个观察支持这一假设是在塞默菲浆氏菌病毒感染的研究中,揭示了间隔相应序列是由编码或非编码链集成的。这个CRISPR位点已被验证转录只来自于大肠杆菌、表皮葡萄球菌和火球菌的上端近端侧，(Brouns 等人.2008; Hale 等人. 2008; Marraffi

30、ni 和 Sontheimer 2008); 迄今为止唯一的例外显示的是塞默菲浆氏菌 (Lillestol 等人. 2006; Lillestol 等人. 2009).。一个单向CRISPR转录的结果是将生成的crRNAs补充到病毒的mRNA中。只有一个间隔区可归为反义RNA机制。观察结果通常表明DNA并不是目标。额外的证据,证明DNA是提供一个研究大肠杆菌Cas系统中人工间隔单向的转录工程的目标。生成crRNAs互补的两个编码链和模板链成功地抑制了病毒扩散(Brouns 等人.2008)。此外,一项在表皮葡萄球菌的质粒连接上的研究令人信服地证明了DNA是表皮目标(Marraffini和Son

31、theimer 2008)。一个自然的间隔在表皮葡萄球菌的CRISPR系统有一个质粒结合基因的完美匹配。这个间隔具有抗药性和防止质粒的结合。一个自我剪接的内含子被插入到质粒空间的中心序列。在结合和随后的转录中,这个内含子是拼接的,生成一个包含到crRNA完全互补序列的成熟的mRNA。质体能够避开CRISPR / Cas系统,表明mRNA不是目标;因此,目标必须是DNA,可能不是被crRNA识别的，因为内含子的DNA序列中断了其间隔区。这个发现证实了通过一个额外的实验,目标基因的一个片断在两个方向插入一个质粒。这个片段对质粒的传播并不是必须的。然而, 在两个方向的插入片段显著地减少了转换效率,再

32、次表明DNA是目标。最近,一个特殊CRISPR / Cas系统被描述,即,在火球菌cmr亚型中发现了目标和其降低RNA(后面讨论)。然而,对于这个系统,非自然的目标还未被发现。大多数关于前crRNA和目标干扰的生物化学和机械学的信息来源于之前提到的大肠杆菌和火球菌的模型系统，基于CRISPR阻力的需求在大肠杆菌BL21中确定。人工CRISPRs被设计为噬菌体的四个不同基因的目标。级联的过表达的和CRISPR RNA足以产生被级联限制和保护的成熟crRNAs(Brouns等人. 2008)。只有当目标噬菌体与级联共表达时没有CRISPRs阻力被观察到。然而,这加载crRNA级联与Cas3蛋白质的

33、共表达导致的大幅噬菌体感染阻力的增加。蛋白质Cas3的两个域的作用有待阐明,但它很容易推测,HD核酸酶域使目标DNA分开。这个Cse亚型来自大肠杆菌K12的目标DNA,但它是如何区分自身DNA(即CRISPR,包含一个与crRNA互补的间隔区)和异物DNA(入侵者)?最近一项在葡萄球菌表皮的研究中表明，原间隔的侧翼序列在自身DNA与异物DNA识别中是至关重要的，从而产生干扰（marraffini和特海默尔2010b）。结果表明，有针对性接合的质粒可以绕过由CRISPR/Cas系统的宿主产生的抵抗力，如果下游三个基因的原间隔CRISPR重复序列是互补的（marraffini和特海默尔2010b）

34、。然而，在其他亚型中，聚丙烯酰胺可能有助于防止自身免疫入侵存在的有针对性的DNA序列，而不是CRISPR脱氧核糖核酸序列。由聚丙烯酰胺决定是否入侵核酸以嗜热链球菌为目标的情况，可以推导出噬菌体突变的序列，因此可以逃避CRISPR / Cas系统（德沃等人。2008）。这两种机制的自身DNA与异物DNA识别似乎是根本不同的。在表皮葡萄球菌下游序列的原间隔碱基对的潜力与CRISPR的重复序列确定DNA是否有针对性，例如，聚丙烯酰胺决定嗜热链球菌的DNA是否有针对性。绕过表皮葡萄球菌的免疫，入侵者可以只有变异的侧翼核酸序列互补的重复基因，而在嗜热链球菌，入侵者可以向任何其他聚丙烯酰胺序列变异。 有趣

35、的是，从古菌P.furiosus的 Cas-系统中最近报导：有能力与目标干扰的是RNA，而不是DNA（黑尔等人。2009）。通过Northern杂交分析，一个cmr-型蛋白复合物被确定，形成一个稳定的相互作用的 crRNAs( psiRNA) （黑尔等人2008、黑尔等人2009）。该crRNAs 有39和45个核苷酸长，含有相同的5端手柄，但3端尾部却是不同的。从Pyrococcus分离出的RNP复合物由六种不同的Cas蛋白质组成：Cmr1 6。cas6不是这个复合物中的一部分（黑尔等人.2009），不像它的功能模拟CasE，这是一个核心亚基在大肠杆菌中的级联复合物（即：Cse复合物）（br

36、ouns等人.2008）。孤立的RNP复合物的裂解互补RNA而不是ssDNA。39和45的核酸大小的crRNAs导致在靶mRNA上的两个不同的切割位点。这两种裂解的上游14核苷酸的3末端的crRNA，表明裂解的分子标尺机制(Fig. 4B)。重组的RNP复合物的纯化亚基显示，除了Cmr5对目标RNA的裂解是必不可少的（黑尔等人2008.黑尔等人的2009).Cmr2蛋白是 Cmr复合体的一部分,它包含一个聚合酶域，融合一个HD-核酸酶结构域。而聚合酶的生物功能还是未知的，HD-核酸酶可能负责目标RNA的降解。至少源于Cmr复合物的2个蛋白与表皮葡萄球菌中csm模块编码的蛋白质是有相关的（图1A

37、）。聚合酶Cmr2 和 Csm1相关， RAMP 蛋白 的Cmr4 与 Csm3相关（柄等人.2005）。从表皮葡萄球菌的 Csm-型系统已被证明在体内的目的DNA，这是对比观察体外RNA裂解Cmr复合物的活性。未来的生化和体内的分析在解决这个明显的矛盾上是必需的。4与真核生RNAi的类比 真核生物中小的调控RNA的功能和生物合成的crRNAs和目标干扰机制，显示惊人的类比。真核细胞的RNA的调节可以分为三大类：内源性miRNA，这个miRNA一般在宿主基因的表达中是沉默的，piRNAs在动物生殖细胞中是沉默的转座因子，还有siRNA，她是可以参与病毒RNA沉默。总之，siRNA来源于双链RN

38、A，它是由Dicer酶随机裂解的，产生片段的3端二核苷酸突出。随后，Dicer酶结合突出部位和根据分子标尺机制切割远离第一次切割位点的20个碱基，产生短的ds RNAs 的3突出端和5端磷酸(伯恩斯坦等人.2001； 麦克雷等人2006； 麦克雷和合著多德纳2007)。这些ds RNAs被转移到在 RNA诱导的沉默复合物(RISC)的Argonaute家族的蛋白，它也包括Dicer 酶和一个dsRNA结合蛋白；后者决定，双链RNA分子的方向是被装载到 Argonaute家族的蛋白（泊等人.2004）。Argonaute蛋白识别的乘客链并降解它，保留导链（兰德等.2005）。当RISC遇到一个完全互补的RNA，它可以和Watson-Crick碱基配对。随后，Argonaute裂解开的互补的目标 RNA链，在远离10个核苷酸的5末端的导向，之后的目标片段被释放和 RISC 复合物被回收，为新的目标降解事件，最终导致病毒的基因沉默（鲍尔库姆2004）（图4C）。 虽然比较原核生物和真核生物的RNA，他们的经过是不一样的并且有一些功能和机械的类比。两个方面的中RNA和对RNA的小干扰都先来自于大型RNA。此外，无论是从cmr