具广泛结合能力的新家族碳水化合物结合组件的鉴定

1、具广泛结合能力的新家族碳水化合物结合组件的鉴定本课题组前期工作从来源于水牛瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶C5614-1中鉴定了一个新的碳水化合物结合组件（CBM）,命名为CBMC5614-1与其 它已知的CBM没有同源性,它位于该蛋白的C末端,长度为189个氨基酸,该CBM 的特点是能结合广泛的多糖。首先构建了编码不同长度的缺失N端或C端的CBMC5614-的重组质粒,并表达和纯化了缺失多肽。通过缺失多肽与多糖底物的结合能力的检测确定了CBMC5614-1的第16-149aa是具有结合功能的最短区域。根据 CBMC5614-最短的功能区段,在 Gen Ba nk数据库中搜寻到15个同源多肽,进

2、化树分析表明该16个同源多肽分为 两个明显的分支 , 分支内多肽之间氨基酸的一致性在 25%以上, 分支间的一致性 在20鸠下，虽然两个分支间的同源性低，但是与其他家族的CBM如 CBM37比较, 它们还是在一个大分支上 , 说明它们之间还是具有亲缘关系的 , 也表明这些同源 多肽形成两个亚家族。其中亚家族a中包括CBMC5614-亚家族a的代表成员）、ADR64668-1 CAJ19146 ADR64668-2 ADR64664和 AEK98797;亚家族 b 中包括 CBMC35-2亚 家族 b 的代表成员 ） CBMC29-2 CBMC67-1 ADR64666 ADR64663 ABX

3、76045 ADK55024 AAC36862 ABB4620C和 ADA62505 选取 CBMC5614-的 7 个具有代 表性的同源多肽的编码序列进行克隆重组并表达及纯化了表达产物 , 其中亚家族 a中选了 2个（ADR64668-1和CAJ19146和亚家族b中选择了 5个（C35-2、 C29-2、C67-1、AAC36862W ABB46200。对同源多肽进行多糖底物的结合能力检测,结果显示除ABB46200外，它们具 有与CBMC5614-相同的多糖结合谱,确定这些同源多肽均为 CBMABB46200与其 他同源多肽相比 ,结合多糖底物谱窄一点 , 而且与多糖的结合能力比其他同源

4、多 肽也较弱。文献报道已经证实芳香族氨基酸在 CBM识别和结合多糖底物中起重要作用。通过同源多肽之间的多序列比对 ,发现所有的同源序列中有 3 个保守的芳香族氨基酸,分别W17 丫48和H117（编号以CBMC5614-为准）；亚家族a中有12个保守 的芳香族氨基酸 （F9、 W17、Y41、F45、 Y48、F53、Y55、W60、 F74、F99、Y104） 以及一个保守的杂环族氨基酸（H117）（编号以CBMC5614-为准）;亚家族b中有11 个保守的芳香族氨基酸（Y7、丫11、W15 F19、F21、丫34 丫45 丫54 丫73 F87、 W133编号以CBMC35-2为准）。用重

5、组PCR的方法分别对各亚家族代表成员（CBMC5614-1和CBMC35-2的保 守的芳香族的氨基酸均定点突变成丙氨酸 , 进行了各定点突变多肽对各种多糖底 物结合能力的定性检测。结果显示,在CBMC5614-的突变体在对可溶性底物进行 结合时,W17A和 W60A寸多糖的结合能力完全失去，丫48A、F45A F74A和H117A 的结合能力有一定的下降;CBMC5614-1的突变体对不可溶性底物进行结合 时,W17A W60A和Y48A的结合能力大幅度的下降，F45A、F74A和 H117A的结合能 力也有一定的下降趋势。在CBMC35-突变体在对可溶性底物结合检测中发现，W133A的结合能力几乎完全失去，丫11A、W15A F19A的结合能力大幅度下降，F21A、Y34A Y54A F73A 结合能力均稍微减弱；但CBMC35-2的突变体多肽对不可溶性多糖的结合能力都 没有明显改变。上述研究表明,CBMC5614-1的同源多肽均为CBM以及它们的3个