mRNA差异显示技术

1、Page 1临床兽医学临床兽医学2012级级Page 2 一、一、 二、二、DDRT-PCR的发明及其基础的发明及其基础 三、三、mRNA差异显示技术的原理：差异显示技术的原理：Page 3 高等生物大约有35 万个不同的基因，在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有10%20%的少部分基因被，这种选择性表达是在发育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心机制。因此，比较不同组织之间，或相同组织在不同生理条件下，或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异，可分离并克隆出这些特异性表达的基因。研究基因差异表达的主要技术有 差别杂交(differential

2、hybridization) 扣除（消减）杂交(Subtractive hybridization) mRNA差异显示技术 (mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR) 抑制消减杂交法(suppressial substractive hybridization ,SSH) 代表性差异分析 (Represential display analysis ,RDA) 交互扣除RNA差别显示技术(RSDD) 以及基因表达系列分析和电子消减Page 4mRNA差异显示PCR技术是1992年由美国波斯顿Dena-Faber

3、癌症研究所的Liang Peng 博士和Arthur Pardee 博士建立起来的一种用于鉴定和克隆哺乳动物正常生理状态和异常状态细胞之间差异表达基因的方法,是目前筛选差异表达基因最有效的方法,同时，研究mRNA差异相对于研究DNA差异而言。它排出了非编码区（内含子）的影响，从而使得研究结果更加接近于真实。 Page 5二. DDRT-PCR的发明及其基础n 由Liang于1992年创立n是分离差异表达基因强有力的工具n在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便n 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术n1）RT-PCR技术n2）以特定引物进行的PCR技术n3）DN

4、A电泳技术 Page 6三、mRNA差异显示技术的原理： mRNA差异显示技术的主要原理是利用cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差异。其中，反转录技术中使用了一系列能与mRNA的Poly（A）尾巴相结合的锚定寡聚脱氧核苷酸引物OligoT12MN。锚定引物与mRNA的Poly（A）+的两个碱基，在反转录酶的作用下可以启动mRNA群体反转录。Page 75 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 Poly(A) RNA5 T12MN 3锚定引物锚定引物逆转录逆转录5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5变

5、性变性5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5退火退火5 T12MN 3锚定引物锚定引物寡核苷酸随机引物寡核苷酸随机引物3M N TTTTTTTTTTTT 5延长延长dNTP、Taq聚合酶聚合酶3M N TTTTTTTTTTTT 55MNAAAAAAAAAAA 3变性、退火、延伸变性、退火、延伸电泳电泳显示显示T12MN(M为为A、G、C，N为为A、T、G、C) 启动启动cDNA第一链合成第一链合成不同长度的不同长度的PCR产物产物回收差异条带，再扩增回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对，克隆测序，同源比对随机结合到随机结合到cDNA链上链上Pag

6、e 8四.DDRT-PCR目前的应用领域n主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、生殖等领域n动植物遗传、育种，动物营养及微生物等领域Page 9五. DDRT-PCR一般操作步骤n总RNA的提取与反转录nRT-PCRn聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带的回收nPCR在扩增及其产物的回收n测序和数据库比对分析n实时定量PCRmRNA差异显示技术简略流程图Page 11六. DDRT-PCR的优点n以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础n灵敏度高，仅需0.2g的总RNAn可以同时比较多个样品间基因表达的差异 n可以同时检测到“上调”及“下调”的基因 n时间短，实验过程中可步步验证比较 n可进行多

7、基因家族的表达分析 Page 12 七.DDRT-PCR的缺点n 假阳性高 n 样品mRNA可能有部分降解 n 有少量的DNA污染 n 单条带可能由一种以上cDNA 片段所构成 n 有些特异cDNA片段太短,在Northern杂交时检测不到杂交信号 n PCR扩增了一些稀有mRNA片段,在杂交时显示不出差异表达的信号 n 绝大多数差异条带仅含有3-UTR 500bp以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因 n 对低丰度mRNA检出率低Page 13八.DDRT-PCR的技术改进n 针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面做了大量改进：n 引物设计n 反应条

8、件的优化n 显示方法n 假阳性鉴定Page 14引物设计n mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增效果最好n 王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列，提高了PCR反应的严谨性n Liang发现910个mer长度的随机引物比较适宜n Liang还发现，当长度为13bp，在5端增加Hind酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特异性Page 15反应条件优化nRNA模板量在2-3g时，能扩增出较多的条带n不同条件下dNTP浓度不是固定不变的 n1.5-2.0mmol/L的Mg2+浓度效果较好n40-42的退火温度通常能得到较好的扩增效果，周宁新等在PCR的头两个循环，用低严谨的退火温

9、度36，在随后的循环中退火温度提高到45，获得了很清晰的电泳图谱Page 16显示方法n 最初DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放射自显影成像nSanguinetti介绍了一个快速银染方法，只需15分钟，而且容易克隆回收 nRompf等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异cDNA片段n余桂华等建立了荧光mRNA差异显示方法，最大限度地降低了假阳性Page 17假阳性的鉴定n Northern blot仍是鉴定差异的一个主要手段；分析较多条带，反向Northern blot是较为切合实际的选择n Heinz通过SSCP分析排除了非差异表达的cDNA污染n Callard把纯化后的PCR 产物分

10、成两部分:一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆n Sompayra设计了向5步移的方法mRNA差异显示技术现在已经成功运用于动物的胚胎发育、组织分化、生长因子激活与抑制、细胞周期控制、，在植物无性繁殖、形态发生、次生代谢、抗逆抗病等方面被用来进行基因的鉴定、克隆以及功能研究，并取得很好的结果。概括起来其主要用途可以归纳为以下三点： 第一，寻找差异表达的基因。 第二，研究个体、种群或品种间转录水平上的遗传变异。 第三，鉴定经济动物中控制重要数量经济性状位点的基因。 由于人们认识的基因还不够全面，特别是对生物发生、发育及病理生理过程中某些新的功能基因和调控作用认识不足，因此差异显示技术将在研究生物进化、损伤修复、癌变及治疗反应过程中具有重要意义。差显技术的发现为在该领域中寻找新基因提供了有用的工具。相信随着不断的应用和技术的不断改善，差异显示技术必越来越多的在生命科学以及医学领域的