双萤光素酶报告基因的应用-常见载体及案例简介

1、精品文档双萤光素酶报告基因的应用，常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测（ Dual-Luciferase Reporter Assay）通常以萤火虫萤光素酶 (Firefly luciferase) 为报告基因，以海肾萤光素酶 (Renilla luciferase) 为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、 动态范围广、 应用灵活等优势，广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。Fireflyluciferase （简称 F-Luc ）以萤光素 (luciferin)为底物，在2+Mg 、ATP和氧分子存在条件下，催化luciferin氧化成 oxyluciferin，在此过程

2、中发出最强波长在560nm左右的生物萤光 (bioluminescence)。 F-Luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列，可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在 F-Luc 的 3 UTR区域插入待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。Renillaluciferase （简称 R-Luc ）以腔肠素（ coelenterazine ）为底物，在氧分子存在的条件下催化 coelenterazine氧化生成 coelenteramide，此过程中发出最强波长在465nm左右的生物萤光。 R-Luc 通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正

3、input误差的内参信号。生物萤光产生反应式一、应用方向1.验证 microRNA 同 mRNA靶向互作。将待测mRNA的 3UTR序列插入报告基因载体，再共转入该 microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。2.验证 microRNA 同 lncRNA 靶向互作。将候选的lncRNA 序列插入报告基因载体中F-Luc 的3 UTR区域，检测萤光素活性。3.启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k 左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。4. 启动子 SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶

4、报告系统分析其相对活性。1欢迎下载精品文档5. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子， 可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。例如，在GPCR研究中，将cAMPresponseelement （ CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。 又如，将 HIF1 的响应原件hypoxia-responsiveelement(HRE)

5、插入 luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。二、常用萤光素酶报告基因载体pGL3-BasicpRL-TK。2欢迎下载精品文档pmirGLO三、经典案例案例一题 目 ： Longnon-codingRNA linc00673regulatednon-smallcelllungcancerproliferation,migration,invasionandepithelialmesenchymaltransitionbyspongingmiR-150-5p期刊： Molecular Cancer小结：验证linc00673具有 miR-150-5p 的靶向结合位

6、点。将linc00673包括预测结合位点的序列克隆到pmirGLO- linc00673-WT，同时构建靶位点突变的pmirGLO- linc00673-MUT，分别共转 miR-150-5p mimics 及 NC mimics ，结果显示 miR-150-5p 转染组的相对荧光值降低，提示存在靶向结合。图： RNA与质粒共转染293T， 24h 后双萤光素酶检测。3欢迎下载精品文档案例二题目： SOX9 indirectlyregulatesCEACAM1 expressionandimmuneresistanceinmelanoma cells期刊： Oncotarget小结：验证SOX9对于 CEACAM1的转录调控作用。分别使用了两种黑色素瘤细胞526mel 和624mel ，对 CEACAM1的启动子区域分别选择了600bp-200bp 的截短片段，共转染过表达SOX9，显示 SOX9能够抑制CEA