Real-time PCR及其质量控制

1、Real-time qPCR及其质量控制及其质量控制 王 玮Real-time PCR 应用 绝对定量 相对定量 等位基因分型 阴阳性判定 microRNA 荧光定量PCR数学原理 基线 阈值 Ct值 DNA 0 由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异 同时扩增96的相同样品的结果 扩增曲线：四个阶段 线性图谱 对数图谱 平台期 线性增长期 指数增长期 基线期 平台期 线性增长期 指数增长期 基线期 基线 阈值 Ct值 DNA0 什么是基线？ 基线就是扩增曲线中的水平部分。 对数图谱 线性图谱 基线 阈值 Ct值DNA0 什么是阈值？ 1. 基线（空白）信号的产生是由于

2、测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于105。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。 什是C T值？ 从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数 线性图谱 对数图谱 CT值 CT值 基线 阈值 Ct值DNA0 PCR理论方程只在指数期成立 线性期 lg DNA y = x(1+e)n 指数期 为什么C T值 DNA0 ？ N = N0 x (1+e)nN：产物分子数；N0：起始分子数 e：扩增效率； n:循环次数 循环数 为

3、什么CT值 DNA0 ？ Rn= RB+ X0(1+ e)n Rs 第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。 RCT= RB+ X0(1+ e)CT Rs lg (RCT -RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT -RB) lgRs 设n=CT，则： log ) log( log X R R R - - S B T O C T + - = ) 1 log( ) 1 log( E E + + X X 即 CT =

4、 - k lg X0+ b（线性方程） CT值 CT = - k lgX0+ b lg 起始DNA 标准曲线：CT值对DNA0作图 成功的定量PCR 荧光定量PCR化学原理 SYBR Green I作用机理 数量关系 1.每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 2.染料一结合，就产生荧光信号 3.信号强度与DNA分子总数目 R Q R Q TaqMan探针的FRET TaqMan Probe E E TaqMan作用机理 上游引物 R Q 3 下游引物 R Q 5 3 数量关系 TaqMan探针 5 3 5 5 3 1.每产生一条DNA链，就切断一条探针 2.每切断一条探针，就产生一

5、个单位信号 3.信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 Real-time PCR 应用 绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD) 基因突变分析 SNP研究 物种鉴定、菌株鉴定 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-) 实时PCR分析 绝对定量 相对定量 提供精确的起始材料 相对数量差异 根据标准曲线 提供数量测量 绝对定

6、量与相对定量的定义 绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常 所说的拷贝数。 相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序 列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一 个时程研究中处于零时的样本。 The well contains 400 target copies Y= mx+b Ct values Cts 01234567 Log copy number 绝对定量：从荧光到拷贝数 相对定量：参照因子 Calibrator 用以比较结果的基准 time t =0 t=12 total RNA total RNA total RNA to

7、tal RNA cDNA cDNA cDNA cDNA T=24T=48相对定量：内对照 Endogenous Control 用以标准化样品操作 time t =0 t=12t=24t=48 total RNA total RNA total RNA total RNA cDNA cDNA cDNA cDNA 相对定量研究软件 同时分析多达10块反应板的基因表达数据 多至960个数据点的单击分析 数据直观 通过DDCT(比较 Ct)法完全自动分析数据 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出 终点检测 终点检测 阴性阳性鉴定 阴性阳性鉴定 等位基因分型 等位基因分型 目标序列的有无 突变的存

8、在形式 等位基因分型 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的 引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用 于检测某个核酸序列的变异。 每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核 苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。 目标序列的实际量不确定。 正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测 FAM VIC VIC FAM FAM VIC 基因分型检测 Homozygote for FAM-specific allele Homozygote for VIC-specific allele Heterozygote for

9、both alleles 等位基因自动识别软件 加速数据分析 等位基因分组识别 每一个孔的质量评分 用户自定义的质量评分 标准 基于每一个标记的识别 限制用户的主观干扰 阴性阳性鉴定 定义：阳性/阴性实验是一种终点分析，它可以确定某个样本中是（阳 性，用加号表示）否（阴性，用减号表示）存在一个特异性目标序列。 在终点分析中，数据是在PCR过程结束时获得的。 什么是IPC？IPC是一种阳性内对照，它被用在阳性阴性实验中，用 于监测PCR过程并确定阴性结果不是因为PCR失败而造成。，IPC包 括一个模板、一组引物和一个荧光标记（VIC）的探针，被加到反应 板的每一个孔中。 阴性结果示例 阳性结果示

10、例 microRNA MicroRNA(miRNA)是一种 22个碱基左右的内源性单链 小分子RNA 由带茎环结构的双链RNA前 体剪切而成 具有高度保守性、时序性和 组织特异性 通过与特异mRNA结合，抑 制目标基因表达或降解 mRNA *mature active strand miRNA Expression 1. Transcription 2. Hairpin release in the nucleus 3. Export to cytoplasm 4. Dicer processing 5. Strand selection by RISC 6. Translational re

11、pression Mechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation 为何研究miRNA？ miRNA已被确认为一类新的基因调控因子，参 与了细胞的发育、分化和联络 对miRNA功能的研究将有助于设计siRNA干扰 实验 miRNA有可能成为新的生物分子标记 有重要的临床应用价值 Northern Blot (杂交法) Homegrown technology and easy to access (易于操作) Large sample amount requirement (ug scale) (需大量样品 Low dynamic range (t

12、wo orders of magnitude) (可测范围低) Mismatch hybridization often cannot distinguish well between miRNAs that only have small sequence differences (错配杂交问题) Microarrays (芯片法) High throughput (高产出) Improved dynamic range (可测范围较宽) Large sample RNA requirement, approximately 5 g per array (需大量样 品) Difficult

13、or impossible to distinguish between the Pre-miRNA and miRNA (很难区分前体miRNA and 成熟miRNA) Do not distinguish well between miRNAs that have only small differences in sequence. (对类似结构的miRNA分辨率差) Quantitative Real-Time PCR (实时定量PCR) Dramatically less sample requirement (只需微量样品 Significantly wide dynamic r

14、ange (7 logs) (非常宽的可测范围) High sensitivity and specificity (高灵敏度, 高特异性) However, how to design a TaqMan real-time PCR assay on a 22 base polynucleotide fragment? (但是, 如何设计这样一个靶物只有22个碱基 TaqMan real-time PCR?) Solution: TaqManMicroRNA PCR Assays miRNA分析的技术挑战 Precursor miRNA Mature miRNA Workflow mirVan

15、a miRNA Isolation Kit TaqManMicroRNA RT kit TaqManMicroRNA Assays TaqManUniversal Master Mix,No UNG Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Five Fully I

16、ntegrated Systems for Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System mirVana miRNA Isolation Kit 专业高效回收小分子RNA 富集小于200 nt RNA，提高下游试验灵敏度 方便快捷，30分钟完成整个过程 理想的 miRNA, siRNA, shRNA, and snRNA分析 试剂盒 适合各种组织和细胞材料 Step 1: Stem-loop RT cDNA Forward primer Step 2: Real-time PCR Q F Four oligo

17、s per miRNA 1. RT primer 2. Forward primer 3. Reverse primer 4. TaqMan probe Two enzymes required 1. Reverse transcriptase 2. AmpliTaq GoldDNA Polymerase RT primer TaqMan MicroRNA Assays miRNA Reverse primer TaqMan probe miR-16 let-7amiR-20 miR-324-5 发夹状引物的反转录miRNA分析高度的重现性 4 miRNAs个样 本，16 个重复， 2名操作者

18、的实 验中 平均标准方差: 0.1 定量结果偏差: 0.6% TaqManUniversal Master Mix 实验证明可以达到7个数量级的线性范围 New release TaqManArray Human MicroRNA Panel 快速，高效的miRNA分析方法 同时检测多达365个miRNA miRNA定量PCR相关应用 转录后基因调控研究 细胞分化及神经信号传导 临床应用: 疾病诊断及治疗 耐药性研究 基因疾病治疗 新生物标志的发现 Primer Express 目前世界上唯一专业用于设计定量引物和 探针的软件 随机配送 Over 700,000 assays designed to Arabidopsis Drosophila C. elegans Rhesus Macaque Human Mouse Rat Canine TaqManGene Expression Assays A single tube contains Forward Primer Reverse Primer TaqManprobe Optimized at