简便快速的PCR技术

1、简便快速的简便快速的PCR技术技术依赖核酸序列的扩增技术依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；NASBA) 反应体系：反应体系： 缓冲溶液缓冲溶液 AMV逆转录酶逆转录酶 T7 RNA聚合酶聚合酶 RNase H 引物引物(下游引物下游引物5端带有端带有T7RNA聚合酶聚合酶启动子序列启动子序列)。依赖核酸序列的扩增技术依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；NASBA)原理：原理： 靶靶RNA经经AMV逆转录，形成逆转录，形成RNA:DNA杂交体杂交体 R

2、Nase H降解杂交体的降解杂交体的RNA，剩下单链，剩下单链DNA AMV以其为模板以其为模板,合成含合成含T7RNA聚合酶启动子的聚合酶启动子的双链双链DNA T7RNA聚合酶以其不断转录出靶聚合酶以其不断转录出靶RNA 进入新一轮扩增循环进入新一轮扩增循环 产物主要为反义单链产物主要为反义单链RNA、RNA:DNA杂交体和杂交体和双链双链DNA。依赖核酸序列的扩增技术依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；NASBA)特点：特点： 可直接扩增特异性单链可直接扩增特异性单链RNA 整个反应不需整个反应不需PCR仪，无需温度

3、循环，没仪，无需温度循环，没有高温变性步骤，不会受到外来双链有高温变性步骤，不会受到外来双链DNA的污染。的污染。 反应速度快，忠实性好，特异性强，敏感反应速度快，忠实性好，特异性强，敏感性高。性高。 加入变性步骤，加入变性步骤， 也能扩增双链也能扩增双链DNA。环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(loop一一mediated isothermal amplification，LAMP)反应体系反应体系: 缓冲液缓冲液 具有链置换特性的具有链置换特性的DNA聚合酶聚合酶 dNTP 模板模板DNA 能够识别靶能够识别靶DNA 6个特异序列的个特异序列的4条引物。条引物。引物为引物为2条内引物和

4、条内引物和2条外引物条外引物环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(loop一一mediated isothermal amplification，LAMP)哑铃状模板合成阶段哑铃状模板合成阶段 引物引物FIP首先和首先和F2c结合启动互补链的合成，形成结合启动互补链的合成，形成双链结构双链结构(图图1b)。 F3再和再和F3c结合，启动链置换反应，释放出结合，启动链置换反应，释放出1条条FIP连接的互补链，在其一端能够形成环状结构连接的互补链，在其一端能够形成环状结构(图图1d)。 这条单链这条单链DNA，又可作为模板，在另一端分别结，又可作为模板，在另一端分别结合合BIP和和B3，合成，合成

5、1条双链，并置换出条双链，并置换出1条哑铃状的条哑铃状的DNA(图图1f)。 哑铃结构很快与其一端哑铃结构很快与其一端F1c和和F1互补，而由自我引互补，而由自我引物延伸机制合成物延伸机制合成1种双链的茎环结构种双链的茎环结构DNA(图图1g)。这种茎环结构的双链这种茎环结构的双链DNA是循环反应的原料。是循环反应的原料。循环反应阶段循环反应阶段 FIP和双链茎环结构和双链茎环结构DNA(图图Ig)中的环状结构结合，形成中的环状结构结合，形成1种有缺口的过渡性茎环结构种有缺口的过渡性茎环结构DNA，该结构在茎上含有靶序，该结构在茎上含有靶序列的列的1个额外反向复制序列，在对面的末端，通过个额外

6、反向复制序列，在对面的末端，通过BIP形形成成1个环状结构。个环状结构。 在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的产物为茎环产物为茎环DNA组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎环组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜的结构结构和类似花椰菜的结构(含有在同一链上由退火形成的，含有在同一链上由退火形成的，在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构)。环介导等温扩增技术环介导等温扩

7、增技术(loop一一mediated isothermal amplification，LAMP)扩增结果判定：有扩增结果判定：有3 种判定方法种判定方法 1、琼脂糖电泳后，用、琼脂糖电泳后，用EB或或SYBR Green I 染色检染色检测。测。 2、产物中加入、产物中加入M g + 试剂，肉眼观测副产物焦磷试剂，肉眼观测副产物焦磷酸镁沉淀：阳性酸镁沉淀：阳性-液体浑浊，液体浑浊， 静置有白色沉淀。静置有白色沉淀。 3、产物中加、产物中加SYBR Green ， 肉眼观察颜色反应：肉眼观察颜色反应： 绿色阳性，绿色阳性， 橙红色阴性。橙红色阴性。优点优点 灵敏度高灵敏度高 能检测到比能检测到

8、比PCR低低10倍的拷贝数。用倍的拷贝数。用3一一5个细胞样本个细胞样本就可进行动物胚胎性别鉴定。就可进行动物胚胎性别鉴定。 特异性强特异性强 LAMP引物需与靶序列上的引物需与靶序列上的6个特异部位准确结合，因个特异部位准确结合，因此能获得比此能获得比PCR更高的特异性。更高的特异性。 速度快速度快 LAMP是恒温扩增反应，没有是恒温扩增反应，没有PCR反应中温度变化的耗反应中温度变化的耗时，在时，在30-60min内即可完成反应过程。另外，增加环引物内即可完成反应过程。另外，增加环引物还可缩短时间，大大提高了检测的效率。还可缩短时间，大大提高了检测的效率。 设备简单设备简单 LAMP反应只需一个简单的恒温器。反应只需一个简单的恒温器。 产物